[发明专利]一种固液结合制备齐考诺肽的方法

说明书

本发明涉及多肽合成领域，本发明采用固液结合的方法制备齐考诺肽，能够很好的避免杂质肽的产生，提高粗肽纯度，降低生产成本。本发明首次采用二肽单体Fmoc‑Gly‑Lys(Boc)‑OH、Fmoc‑Gly‑Ala‑OH、Fmoc‑Leu‑Met‑OH和Fmoc‑Gly‑Ser(tBu)‑OH固相合成齐考诺肽；同时引入半胱氨酸单体Fmoc‑Cys(tButhio)‑OH和Boc‑Cys(tButhio)‑OH参与合成齐考诺肽，避免了线性肽裂解过程中巯基被氧化，能够有效的提高线性肽的纯度，从而提高终产品的收率，有利于合成规模的放大，降低生产成本。

技术领域

本发明涉及多肽合成领域，特别涉及一种固液结合制备齐考诺肽的方法。

背景技术

齐考诺肽(ziconotide)是由爱尔兰Elan公司研制的一种N-型钙通道阻滞剂，是从圆锥型蜗牛软体动物体内分离出的芋螺毒素，可用于鞘内给药的非阿片类镇痛药物。齐考诺肽注射液(商品名：PRIALT)于2005年1月11日首次在美国获批上市，并于2006年相继在英国、爱尔兰和德国上市，于2007年在瑞典上市，之后在奥地利、比利时、希腊、荷兰、卢森堡、意大利、西班牙、葡萄牙、丹麦、芬兰、法国等多国上市，适用于适合鞘内注射而其他治疗方法(比如全身性镇痛药、辅助治疗或鞘内注射吗啡)不能耐受或不能控制的严重慢性疼痛的成人患者的治疗，相比于阿片类镇痛药物，具有疗效好、无耐药性和无成瘾性等优势。

齐考诺肽是由3对二硫键连接在内的25个氨基酸组成的多肽，分子量为2639.12，肽序较长且结构复杂，C1-C16、C8-C20和C15-C25三对二硫键使多肽折叠成为ω结，除此之外还有3股β折叠进一步稳定其空间结构。其氨基酸序列和二硫键桥接模式如下所示：

齐考诺肽的合成，国内多采用固相Fmoc化学法合成，CN101412752B，CN102268082B，CN107216374A和CN106496315A采用3对不同保护基保护半胱氨酸，分步形成3对二硫键，采用此策略合成，合成周期长，收率较低；采用Fmoc-Cys(TButhio)-OH合成肽树脂，裂解后一步氧化形成3对二硫键，采用碘氧化，会对齐考诺肽肽链造成破坏，导致收率降低；CN103304655A中线性肽的合成使用了Fmoc-Ser(tBu)-Gly-OH、Fmoc-Thr(tBu)-Gly-OH、Fmoc-Lys(Boc)-Gly-OH共3种二肽片段作为原料，避免了[+Gly]-齐考诺肽和[-Gly]-齐考诺肽杂质的产生；CN104974237B和CN109021087A采用片段合成法，固液结合合成齐考诺肽，有效的提高了粗肽纯度，但是会造成合成成本的提高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种固液相结合制备齐考诺肽的方法，主要解决现有合成方法存在的合成周期长，生产成本高，产品收率低不利于后期工业化放大的技术问题。

为实现以上目的，本发明提供以下技术方案：一种固液相结合制备齐考诺肽的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(a)合成二肽单体Fmoc-Gly-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-Ala-OH、Fmoc-Leu-Met-OH和Fmoc-Gly-Ser(tBu)-OH；

(b)以氨基树脂为固相载体，依次和

偶联，得到肽树脂；

(c)裂解得到巯基被保护的线性肽：

H-Cys(tButhio)-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys(tButhio)-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-Asp-Cys(tButhio)-Cys(tButhio)-Thr-Gly-Ser-Cys(tButhio)-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys(tButhio)-NH₂；