[发明专利]一种用于检测端粒酶活性的电化学传感器及其检测方法

权利要求书

1.一种端粒酶活性的电化学检测方法，其特征在于，包含以下步骤：

(1)细胞培养及端粒酶的提取；

(2)金电极处理和DNA的固定；

1)金电极预处理：

a)金电极用氧化铝粉末抛光，得到抛光后的电极；

所述金电极直径：

b)将步骤a)中抛光后的电极浸泡在水虎鱼溶液中2-20min消除吸附的有机物，并用去离子水彻底清洗；

所述水虎鱼溶液具体为V(H₂SO₄)：(30％H₂O₂)＝3：1；

c)再将电极用50％硝酸浸泡10-30min，然后分别用乙醇和去离子水处理电极2-8min，再用氮气吹干后，将电极浸入0.5M硫酸中，用循环伏安法(CV)从0到1.6V进行扫描直到获得稳定的信号；

2)将含巯基标记捕获探针的DNA固定化缓冲液滴加在金电极表面，在潮湿条件下孵育8-16h，捕获探针一端的巯基通过Au-S键连接到金电极表面，然后对修饰的金电极进行冲洗，在电极表面滴入含1mMMCH的Tris-HCl，孵育8-20min；

所述捕获探针的具体序列如下：

捕获探针(DNAS1)，SEQ ID NO.3：5′-GGTACATT-SH-3′；

3)将没有被捕获探针结合的金电极表面封闭起来，以形成良好的无非特异性吸附的自组装单分子层；

(3)端粒酶活性的电化学检测；

1)将10μL端粒酶提取物添加到40μL含有2mM互补探针的延伸溶液中，在37℃反应2h，制得磁珠-DNA复合物；

所述互补探针的具体序列如下：

SEQ ID NO.4：5′-CCCTAACCCTAA-3′；

2)将步骤1)制得的磁珠-DNA复合物收集，用PBS冲洗，然后加入反应缓冲液，重悬磁珠(MB)-DNA复合物，并加入发夹样探针(HP)，核酸外切酶III(ExonucleaseIII,ExoIII)，在25℃孵育20-60min，制得混合物；

所述发夹样探针(HP)具体序列如下：

SEQ ID NO.2：5′-MB-TTTGTACCCTTTTGTGAGTTGGTTAGGGTTAGGG-3′；

3)将步骤2)制得的混合物与捕获探针修饰的金电极共孵育1-4h，之后彻底清洗去除多余的DNA，制得电化学传感器，即可对端粒酶活性进行电化学检测。

2.如权利要求1所述的一种电化学检测方法，其中步骤(1)细胞培养及端粒酶的提取，具体步骤如下：

1)HeLa细胞培养；

2)细胞悬浮分散处理：将处在对数生长期的细胞用PBS洗涤，用胰蛋白酶消化1-3min后，再用PBS缓冲液吹打细胞，使其脱离，制得脱壁细胞；

3)端粒酶提取：收集步骤2)制得的脱壁细胞，离心、重悬并冰浴10-50min，将含有细胞的裂解液在4℃的温度下离心，收集上清液，测定蛋白浓度，所提取物立即使用或储存在-80℃。

3.如权利要求2所述的一种电化学检测方法，其特征在于：

步骤1)中，HeLa细胞培养的条件为：37℃，5％CO₂培养条件下用含有10％胎牛血清的DMEM培养基培养；

步骤3)中，首次离心为1000rpm离心5min；

步骤3)中，冰浴时间为30min；

步骤3)中，第二次离心为12000rpm离心30min；

步骤3)中，用200μL冰冻的1×CHAPS裂解缓冲液重悬；

步骤3)中，用Eppendorf管收集上清液。

4.如权利要求1所述的一种电化学检测方法，其特征在于：

步骤(2)-1)-a)中，氧化铝粉末的粒子大小为1.0、0.3和0.05μm；

步骤(2)-2)中，用1μM的巯基标记捕获探针；

步骤(2)-2)中，在潮湿条件下孵育12h；

步骤(2)-2)中，在电极表面滴入含1mM MCH的10μL Tris-HCl，孵育15min；

所述Tris-HCl溶液的浓度为10mM。