[发明专利]一种类丁二酸酯生产菌的筛选方法

说明书

本发明为一种类丁二酸酯生产菌的筛选方法，其以培养基中丁二酸酯为筛选压力，使目标菌株逐渐富集，分离纯化富集后的菌群得到目标菌株，再测定其类丁二酸酯生产能力，得到类丁二酸酯生产菌。本发明采用的筛选方法为：在菌源扩大培养过程中，以类丁二酸酯作为培养基的唯一碳源，并逐步提高其浓度，最后通过菌株分离纯化，获得单菌落，检测获得的菌株的类丁二酸酯生产能力，获得类丁二酸酯生产菌株。本发明有助于提高筛选类丁二酸酯高产菌的机率，简化操作步骤，降低工作量，提高筛选效率。本发明为类丁二酸酯生产菌的筛选提供了简单高效的新技术。

一、技术领域：

本发明涉及微生物育种技术领域，具体涉及一种类丁二酸酯生产菌的筛选方法，其在类丁二酸酯的环境压力下，类丁二酸酯生产菌在菌源微生物群增殖的过程中，逐渐富集，最后被分离纯化。

二、背景技术：

类丁二酸酯包括琥珀酸、苹果酸、酒石酸的甲醇酯、乙醇酯、丙醇酯、丁醇酯、戊醇酯、己醇酯、芳香酯、甘油酯等单酯和二酯，具有水果清香味、发酵味和花香香气特征。由于类丁二酸酯可作为食品添加剂、有机合成中间体、定香剂、润滑剂与增塑剂等，近年来已被广泛应用于食品、保健品、化妆品、香料、涂料、医药、橡胶与塑料产业等，且市场需求还在逐渐加大。但类丁二酸酯天然来源并不丰富，目前其制备主要以类丁二酸与无水乙醇为底物，采用化学反应合成。

相比较于强酸或金属化合物催化的化学合成法，微生物法生产类丁二酸酯具有无污染、无毒副作用、无腐蚀性且活性产物含量高的优点。一些微生物，如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、贝酵母（Saccharomyces baynanus）、柠檬形克勒克氏酵母（Kloeckera apiculata）、异性汉逊酵母（Hansenula anaomala）、球拟酵母（Torulopsis）、假丝酵母（Candida）、酒酒球菌（Oenococcus oeni）等都具有较强的类丁二酸生产能力。在这些微生物细胞中，以糖代谢产生的酰基基团（琥珀酰、苹果酰等）和发酵液中的琥珀酸、苹果酸、酒石酸等为主要供体，乙醇、芳香醇等是反应辅助物合成类丁二酸酯，生成的类丁二酸酯通过扩散作用，穿过细胞膜进入到发酵液中。

目前，利用已有菌株生产类丁二酸酯受到低产量的制约。构建基因工程菌株是提高微生物法生产类丁二酸酯产量的手段之一，但操作过程比较复杂，且由于基因工程菌株潜在的安全问题，人们还没有普遍接受基因工程菌株在食品、保健等行业的应用。

然而，目前对于类丁二酸酯生产菌的筛选研究较少，使用的筛选方法一般是从菌源中分离出单菌株，再逐个测定其类丁二酸酯的生产能力，这种方法随机性强且工作量大，无法高效地获得高产菌株。另一方面，已从乳制品或发酵产品中筛选出的类丁二酸酯生产菌的产量较低，无法满足生产需要。已有研究显示，其主要限制因素是菌株细胞内酶的种类和活性。在酯酶或酰基转移酶的作用下，类丁二酸-酰基辅酶A与醇生成类丁二酸酯。而酯酶的存在也可使类丁二酸酯被分解为类丁二酸，参与其他的生命代谢。因此微生物类丁二酸酯的生产能力与其类丁二酸酯的利用能力密切相关。基于这一原理，控制培养基中类丁二酸酯，可使类丁二酸酯生产菌株逐渐富集，从富集了大量目标菌株的菌群中分离纯化单菌株，进行类丁二酸酯生产能力的测定，能够有效地提高筛选效率。

三、发明内容

本发明的提供一种类丁二酸酯生产菌的筛选方法，其以培养基中丁二酸酯为筛选压力，使目标菌株逐渐富集，分离纯化富集后的菌群得到目标菌株，再测定其类丁二酸酯生产能力，得到类丁二酸酯生产菌。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种类丁二酸酯生产菌的筛选方法为：在菌源扩大培养过程中，以类丁二酸酯作为培养基的唯一碳源，并在多轮培养中逐步提高其浓度，最后通过菌株分离纯化，获得单菌落，检测获得的菌株的类丁二酸酯生产能力，获得类丁二酸酯生产菌株。