[发明专利]检测mtDNA突变的方法和系统有效
| 申请号： | 201910509687.4 | 申请日： | 2019-06-13 |
| 公开（公告）号： | CN111621552B | 公开（公告）日： | 2022-05-06 |
| 发明（设计）人： | 刘兴国;杨亮;林晓冰;唐海特 | 申请（专利权）人： | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 |
| 主分类号： | C12Q1/6858 | 分类号： | C12Q1/6858;C12Q1/6869 |
| 代理公司： | 北京清亦华知识产权代理事务所(普通合伙) 11201 | 代理人： | 赵天月 |
| 地址： | 510530 广东省*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 检测 mtdna 突变 方法 系统 | ||
1.一种检测微量卵子细胞中mtDNA突变的方法，其特征在于，所述方法用于非诊断目的，包括：
(1)提取微量细胞中的mtDNA，所述微量细胞的个数为1～4；
(2)对所述mtDNA不同预定区域进行PCR扩增，以便获得不同预定区域扩增产物，所述mtDNA不同预定区域叠加后构成mtDNA全长；
(3)将不同预定区域扩增产物进行混合，以便获得mtDNA全长核酸测序文库；
(4)对所述核酸测序文库进行测序，以便获得测序结果；以及
(5)基于所述测序结果，确定待测微量细胞中的mtDNA突变；
所述mtDNA不同预定区域包括线粒体基因组3561-9794区域、9795-14567区域、14562-139区域和115-3560区域；
PCR扩增中，引物具有SEQ ID NO:1～8所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，通过对所述微量细胞进行裂解处理，以便提取所述微量细胞中的mtDNA。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述裂解处理是在裂解液中进行的。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，基于20μL的所述裂解液，所述裂解液包括：17～18μL H2O，1～3μL 10×KOD缓冲液和0.2～0.3μL蛋白酶K。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述细胞与所述裂解液的用量比为：(1～4)：20μL。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述裂解处理是在50～60℃进行40～50分钟，在90～100℃进行1～10分钟，最后保持在1～10℃的条件下进行的。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，对所述mtDNA不同预定区域进行PCR扩增，所述PCR扩增的反应程序为：
或所述PCR扩增的反应程序为：
或所述PCR扩增的反应程序为：
或所述PCR扩增的反应程序为：
8.一种检测微量卵子细胞中mtDNA突变的系统，其特征在于，包括：
核酸提取装置，所述核酸提取装置用于提取微量细胞中的mtDNA，所述微量细胞的个数为1～4；
PCR扩增装置，所述PCR扩增装置与所述核酸提取装置相连，用于对所述mtDNA不同预定区域进行PCR扩增，以便获得不同预定区域扩增产物，所述mtDNA不同预定区域叠加后构成mtDNA全长；
文库构建装置，所述文库构建装置与所述PCR扩增装置相连，用于将不同预定区域扩增产物进行混合，以便获得mtDNA全长核酸测序文库；
测序装置，所述测序装置与所述文库构建装置相连，用于对所述核酸测序文库进行测序，以便获得测序结果；以及
突变确定装置，所述突变确定装置与所述测序装置相连，用于基于所述测序结果，确定待测微量细胞中的mtDNA突变；
所述mtDNA不同预定区域包括线粒体基因组3561-9794区域、9795-14567区域、14562-139区域和115-3560区域；
PCR扩增中，引物具有SEQ ID NO:1～8所示的核苷酸序列。
9.根据权利要求8所述的系统，其特征在于，所述核酸提取装置是通过对所述微量细胞进行裂解处理，以便提取所述微量细胞中的mtDNA。
10.根据权利要求9所述的系统，其特征在于，所述裂解处理是在裂解液中进行的。
11.根据权利要求10所述的系统，其特征在于，基于20μL的所述裂解液，所述裂解液包括：17～18μL H2O，1～3μL 10×KOD缓冲液和0.2～0.3μL蛋白酶K。
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