[发明专利]肾病综合征病变进程相关代谢标志物及其应用

权利要求书

1.一种大鼠模型肾病综合征病变进程相关代谢标志物，其特征在于：所述代谢标志物为双（4-乙基苄基）山梨醇, C16-二氢鞘氨醇, 溶血磷脂酰乙醇胺(22:6), 溶血磷脂酰胆碱(22:5), N-乙醇胺和脯氨酸作为进展性标志物；油酸酰胺，二十二碳六烯酸，14S-羟基-二十二碳六烯酸，二十二碳五烯酸，尿酸，溶血磷脂酰胆碱(20:5)和溶血磷脂酰胆碱(18:1)作为早期标志物；酰基肉毒碱 C18:0，亚油酸肉碱，溶血磷脂酰胆碱(18:3)，DL-色氨酸，吲哚丙烯酸，对甲酚硫酸盐，3-吲哚硫酸盐，胞嘧啶，肌酸酐，鞘氨醇-1-磷酸，L-苏式 - 二氢鞘氨醇和神经酰胺(d18:0/14:0)作为晚期标志物；

筛选所述大鼠模型肾病综合征病变进程相关代谢标志物的方法，步骤如下：

（1）两种阿霉素肾病模型的复制与传统评价：将大鼠随机分为空白对照组，早期阿霉素肾病模型组和晚期阿霉素肾病模型组，早期阿霉素肾病模型组和晚期阿霉素肾病模型组采用尾静脉注射阿霉素进行诱导，建立阿霉素肾病模型；利用肾组织病理损伤程度与尿蛋白定量水平对阿霉素肾病模型进行评价；

（2）差异代谢物的寻找：在不同时间阶段收集各组大鼠的血清样品，对血清进行LC-MS分析，归属出代谢物；液质图谱经处理转换为数据矩阵，导入到SIMCA-P软件进行差异代谢物寻找；

（3）结合统计方法筛选、确定反映肾病综合征病变进程的标志物；

（4）基于代谢物的相对含量，采用热图、相关分析图对代谢物进行确证，并采用ROC曲线对标志物的诊断能力进行评估，最终确定出反应肾病综合征模型的早期、晚期和进展性标志物。

2.根据权利要求1所述的大鼠模型肾病综合征病变进程相关代谢标志物，其特征在于：步骤（1）中两种阿霉素肾病模型的复制的具体方法为：大鼠适应环境一周，收集大鼠24 h的尿液，并记录尿液体积；以大鼠的尿蛋白定量和体重为依据进行初筛，将合格大鼠随机分为空白对照组与早期阿霉素肾病模型组和晚期阿霉素肾病模型组，实验过程中自由饮水进食；早期阿霉素肾病模型组大鼠于第1天尾静脉注射4 mg/kg的阿霉素，随后隔1周，于第8天尾静脉注射2 mg/kg的阿霉素，复制阿霉素肾病早期模型；晚期阿霉素肾病模型组大鼠于第1天一次性尾静脉注射6 mg/kg的阿霉素，复制阿霉素肾病晚期模型；空白对照组以相同的方式给予等剂量的生理盐水；

在模型复制过程中，分别于第0天、第7天、第14天、第28天、第42天早上9:00将空白对照组和早期和晚期阿霉素肾病模型组大鼠分别置于大鼠代谢笼中，于次日早上9:00收集尿液，并记录尿液体积，对收集的尿液样品于4℃，3500 rpm离心15 min后取上清液，置于-80℃冰箱备用；

对尿液采用双辛丁酸BCA法进行尿蛋白定量分析，在562 nm处定量测定大鼠24 h尿液吸光度，依据标准曲线计算尿液蛋白浓度，通过将尿蛋白浓度mg/mL乘以24 h尿体积mL来计算24 h尿蛋白排泄量Upro。

3.根据权利要求1所述的大鼠模型肾病综合征病变进程相关代谢标志物，其特征在于：血清样品进行LC-MS分析具体方法为：采用HESI离子化方式，喷雾电压：正极，3.5kV；负极，2.5kV；毛细管温度320℃；加热器温度300℃；鞘气流速：35arb，辅助气流速：10arb；扫描模式为Full Scan/dd-MS2，采集范围为m/z100-1500，正离子切换采集模式；分辨率采用MSFull Scan 35000 FWHM，MS/MS17500FWHM，NCE为12.5eV，25eV和37.5eV；

所有原始文件，包括C1组与M1组和M2组，都是通过Xcalibur 工作站和CompoundDiscover 2.0导出的，得到了一个独立的峰值表m/z和保留时间；所有样品均采用以下参数进行研究：S/N阈值：3，质量范围：100~1500 Da，质量公差：5 ppm。