[发明专利]粗品羊肝素钠中羊和猪基因含量的qPCR检测方法

权利要求书

1.粗品羊肝素钠中羊和猪基因含量的qPCR检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤一：处理粗品羊肝素钠样品，分别得到用于测量羊DNA和猪DNA的溶液；其中用于测量猪DNA的溶液采用单独的试剂盒提取对猪DNA进行提取；

步骤二：针对待测DNA溶液进行PCR扩增设计引物、PCR反应体系及PCR反应程序；

步骤三：分别使用羊DNA和猪DNA标准品制作相应的DNA含量标准曲线，利用PCR扩增制备的PCR模板，通过计算得到羊和猪DNA含量。

2.根据权利要求1所述的粗品羊肝素钠中羊和猪基因含量的qPCR检测方法，其特征在于，步骤一用于制得测量羊DNA溶液的粗品羊肝素钠的处理步骤为：

（1）称取粗品羊肝素钠溶于肝素酶消化缓冲液，95~100℃水浴溶解，冷却至室温后稀释10倍混匀；

（2）将样品溶液过微米级滤膜，经酶解体系：过滤后样品溶液，肝素酶II，硫酸软骨素酶，加消化缓冲液后震荡摇匀，在23~28℃下水浴24小时；

（3）酶解液用无菌水稀释制得用于羊DNA含量检测的溶液。

3.根据权利要求1所述的粗品羊肝素钠中羊和猪基因含量的qPCR检测方法，其特征在于，步骤一中用于制得测量猪DNA溶液的粗品羊肝素钠的处理步骤为：

（1）称取粗品羊肝素钠溶于肝素酶消化缓冲液，在95~100℃下水浴溶解，冷却至室温后稀释10倍混匀；

（2）将样品溶液过微米级滤膜，经过酶解体系：过滤后样品溶液，肝素酶II，加消化缓冲液后震荡摇匀，在23~28℃水浴下24小时；

（3）DNA试剂盒从酶解液中提取DNA用于猪DNA含量的检测；

所述DNA提取包括如下步骤：①.将酶解液于制备管中，离心，弃废液；②.加入BufferW1，再次离心，弃废液；③.加Buffer W2，离心，弃废液，重复一次；④.再次离心1min；⑤.转制备管于新的离心管中，在制备管的膜中央加入Eluent溶液，65℃水浴静置5min，经离心后即得。

4.根据权利要求1所述的粗品羊肝素钠中羊和猪基因含量的qPCR检测方法，其特征在于，所述步骤二中引物为：

其中，猪源引物：

上游引物：5＇-CCTACGCATTTCACTACAAG-3＇，

下游引物：5＇-GTTTGGGTTGATTGAATCTG-3＇，

探针引物：5＇-FAM -ACTAGCCCCATTATCAGTACTATGCCA-BHQ1-3＇；

其中，羊源引物：

上游引物：5＇-ACGAGGCCTATACTATGGATCATATACC-3＇，

下游引物：5＇-TCCTCATGGTAAAACATAGCCTATGAATG-3＇，

探针引物：5＇-FAM -CTCCTATTTGCGACAATAG-TAMRA-3＇。

5.根据权利要求1所述的粗品羊肝素钠中羊和猪基因含量的qPCR检测方法，其特征在于，所述步骤二中的PCR反应体系为：10×ExTaq Buffer，MgCl₂，dNTP，上游引物，下游引物，探针，ExTaq，ddH₂O，DNA/Sample。

6.根据权利要求1所述的粗品羊肝素钠中羊和猪基因含量的qPCR检测方法，其特征在于，所述步骤二中的PCR反应程序为：预变性 95℃ 10min；变性 95℃ 15s，退火 60℃1min，40个热循环。

7.根据权利要求1所述的粗品羊肝素钠中羊和猪基因含量的qPCR检测方法，其特征在于，所述步骤三中羊和猪DNA含量标准曲线为通过各浓度DNA标准品溶液与其扩增曲线对应的Ct值，得出标准曲线，其中标准曲线的相关系数R的平方≥0.95，阴性对照的Ct值为NoCt。