[发明专利]快速检测细菌的引物、试剂盒及其应用

说明书

本发明涉及快速检测细菌的引物、试剂盒及其应用，属于细菌检测技术领域。本发明提供了快速检测细菌的引物，所述检测用正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述正向引物中的简并碱基W＝A/T，所述反向引物中的简并碱基R＝A/G。本发明所述引物能够实现细菌的快速、广泛、高灵敏度、可定量的检测，应用于细菌检测领域，更适用于细胞以及干细胞产品临床研究和应用中。

技术领域

本发明涉及细菌检测技术领域，具体涉及快速检测细菌的引物、试剂盒及其应用。

背景技术

细菌在自然界分布广泛、种类多、繁殖快、体积小，在临床研究和应用中容易造成细胞污染，危害极大。抗生素能够预防污染和感染，但并不能完全阻止细菌生长，因此对于细菌的实时检测在临床研究中尤为重要。

在《中国药典》中无菌检测的方法主要是培养法，培养法作为无菌检测的金标准检测方法，准确度高，但报告结果通常需要14d，对于生长缓慢的细菌培养时间更长。而临床使用的细胞对细胞的存活率和生长活性要求极高，长时间等待结果再用于临床会影响细胞疗效，尤其是干细胞临床的使用。《干细胞制剂质量控制和临床前研究指导原则》中要求干细胞检测的十大项，其中包括无菌试验，并指出放行检验项目应能在相对短的时间内，反映细胞制剂的质量及安全信息。因此探索能快速检测细菌的方法是临床研究亟待解决的问题。目前有用全自动微生物生化鉴定系统例如梅里埃等检测细菌，是根据生物孔中的生长变化和呈色反应得到结果，该方法操作简单，但仪器成本高，报告结果通常也需要5d。目前还有商业化的快速检测试纸片法，只需培养24h，但该方法易出现假阴性的结果。特异酶的使用、质谱技术、免疫传感器和免疫磁性分离技术特异性高，针对特定的细菌灵敏度高，但广泛性差，对于未知的细菌检测不适用。

发明内容

本发明的目的在于提供快速检测细菌的引物及试剂盒。本发明所述引物能够实现细菌的快速、广泛、高灵敏度、可定量的检测，可应用于细胞产品，尤其是干细胞产品的临床检测及研究中。

本发明提供了快速检测细菌的引物，所述检测用正向引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述正向引物中的简并碱基W＝A/T，所述反向引物中的简并碱基R＝A/G。

本发明还提供了一种快速检测细菌的试剂盒，所述试剂盒包括上述技术方案所述引物和标准品。

优选的是，所述标准品包括含16S rDNA保守区部分序列的pUC57质粒，所述16SrDNA保守区部分序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

优选的是，所述引物的使用浓度为100～400nM。

优选的是，所述试剂盒的Q-PCR反应条件为：95℃，10min；95℃，20s，58℃，30s，72℃，30s，40个循环；95℃，15s，60℃，1min，95℃，15s，60℃，15s。

优选的是，所述试剂盒的普通PCR的反应条件分为95℃，10min；95℃，20s，58℃，30s，72℃，30s，35个循环；72℃，5min。

本发明还提供了上述技术方案所述试剂盒在细菌检测中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述试剂盒在细胞中细菌检测的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述试剂盒在干细胞中细菌检测的应用。