[发明专利]猪NR1H3基因过表达载体质粒的构建方法及其表达水平的检测

说明书

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及猪NR1H3基因过表达载体质粒的构建方法及其表达水平的检测。本发明提供了序列如SEQ ID NO:1‑2所示的用于构建猪NR1H3基因过表达载体质粒的引物，以及猪NR1H3基因过表达载体质粒的构建方法；本发明还提供了序列如SEQ ID NO:3‑4所示的用于检测猪NR1H3基因表达水平的引物，以及检测猪NR1H3基因表达水平的方法。本发明为猪NR1H3基因的功能研究及其应用提供了有效方法和基础。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及猪NR1H3基因过表达载体质粒的构建方法及其表达水平的检测方法。

背景技术

肝X受体α(LXRα/NR1H3)是LXR核超受体家族的成员，作为转录调控因子，其活性受到胆固醇降解产物氧化型胆固醇的调节。NR1H3的生理功能主要是维持胆固醇水平、碳水化合物代谢、脂蛋白代谢和脂肪合成的稳态。LXR具有调节组织脂质生物合成的作用，LXRα影响动物的脂肪沉积和脂肪细胞脂质代谢，是肌肉中脂肪生成的正调节因子。从结构上看，LXRs包含5个结构域，即氨基端的配体非依赖性转录活化结构域、DNA结合结构域、铰链区、配体结合域和羧基端的配体依赖的转录活化域。DNA结合结构域包含一个高度保守的锌指结构，该结构域与靶基因特异DNA结合，启动靶基因的转录，调控靶基因表达；铰链区可保持受体蛋白的稳定性，使受体在二聚化的同时与DNA结合，调控靶基因的表达。

目前对NR1H3基因的研究大多集中在人和鼠上，而关于猪NR1H3基因的研究报道很少。猪NR1H3基因表达载体的高效构建和猪NR1H3基因表达水平的快速、特异、准确检测对于猪NR1H3基因的功能研究具有重要意义。

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供用于构建猪NR1H3基因过表达载体质粒的引物、猪NR1H3基因过表达载体质粒的高效构建方法以及用于检测猪NR1H3基因表达水平的特异性引物和猪NR1H3基因表达水平的快速、特异、准确的检测方法。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：为实现猪NR1H3基因的高效特异扩增以及与表达载体质粒的快速高效连接，本发明通过大量筛选和人工优化获得了用于猪NR1H3基因扩增和过表达载体质粒构建的引物，其序列如SEQ ID NO.1-2所示，该引物能够实现猪NR1H3基因的特异扩增，并且能够与表达载体质粒进行高效的同源重组连接，快速、准确地构建猪NR1H3基因过表达载体质粒，将上述构建的猪NR1H3基因过表达载体质粒导入猪细胞中，可获得过表达猪NR1H3基因的细胞。为便于猪NR1H3基因的表达水平检测，本发明通过大量筛选和人工优化获得了用于荧光定量PCR进行猪NR1H3基因表达水平检测的特异性引物(序列如SEQ ID NO.3-4所示)，与其它引物相比，序列如SEQ ID NO.3-4所示的引物能够实现特异、准确的猪NR1H3基因的表达水平检测。

具体地，本发明提供用于构建猪NR1H3基因过表达载体质粒的引物，包括引物TY-NR1H3-F和TY-NR1H3-R，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1-2所示。

上游引物：TY-NR1H3-F：

5′-CTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCCACCATGTCCTTGTGGGTGGAGG-3′；

下游引物：TY-NR1H3-R：

5′-CACCGTCATGGTCTTTGTAGTCCATCTCGTGCACATCCCAGATCTCAG-3′。

上述引物TY-NR1H3-F和TY-NR1H3-R的序列包含结合猪NR1H3基因的序列和为与载体进行同源重组连接的同源区序列。采用序列分别如SEQ ID NO:1-2所示的引物，能够在保证猪NR1H3基因高效特异扩增的同时，有效提高扩增获得的猪NR1H3基因片段与过表达载体质粒进行同源重组连接的效率和准确率。