[发明专利]EHP和SHIV双重实时荧光定量PCR检测引物探针组合和试剂盒

说明书

本发明提供了EHP和SHIV双重实时荧光定量PCR检测引物探针组合和试剂盒，属于水生动物病原检测技术领域。所述引物探针组合采用双重实时荧光定量PCR检测方法，能够一次性同时利用EHP、SHIV的专用检测引物和探针进行两种病原DNA的扩增。本发明提供的检测试剂盒是一种方便、快速、检测限低，且特异性强灵敏度高准确率高、且能同时检测对虾虾肝肠胞虫、血细胞虹彩病毒的双重实时荧光定量PCR检测，适用于对虾隐性感染的早期监测。

技术领域

本发明属于水生动物病原检测技术领域，具体涉及EHP和SHIV双重实时荧光定量PCR检测引物探针组合和试剂盒。

背景技术

对虾血细胞虹彩病毒(Shrimp Hemocyte Iridovirus，SHIV)最早由Lightner和Redman于1993年在靠近厄瓜多尔的对虾养殖场中的原糙对虾(Protrachypene precipuaBurkenroad)中发现的，病虾症状为活力较差，肝胰腺明显萎缩，肌肉发白，肠道发红、断裂，空肠空胃，鳃、步足及游泳足发黑。2017年，中科院黄海研究所科研人员在浙江严重死亡的南美白对虾上发现一种新病毒，它不属于虹彩病毒科下已建立的五个属，根据虾感染该病毒后的临床症状和病理症状，命名为虾血细胞虹彩病毒(SHIV)。而虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei，EHP)是现阶段养殖对虾特别是南美白对虾的最大威胁，SHIV和EHP是我国对虾养殖过程中两种新发疫病，前者导致虾大量的死亡，后者导致对虾生长缓慢，参差不齐，甚至生长停滞，仅偶尔伴随有白便或者在应激条件下才出现大量死亡，所以养殖投入高结果收获甚微，给养殖业造成巨大的经济损失。

目前，对虾病害种类较多，诊断手段主要包括病理学和生物学方法、免疫诊断法分子杂交、电镜观察及PCR技术。已建立的常规PCR技术，多是一次检测一种病原，检测耗时较长，检测灵敏度和准确性有待进一步提高。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种EHP和SHIV双重实时荧光定量PCR检测引物探针组合和试剂盒，不仅可以同时检测EHP和SHIV两种病原，而且检测灵敏度高、准确性好。

本发明提供的一种EHP和SHIV双重实时荧光定量PCR检测引物探针组合，包括检测EHP的引物探针组合和检测SHIV的引物探针组合；

所述检测EHP的引物探针组合包括如SEQ ID No.1所示的正向引物EHP-F、如SEQID No.2所示的反向引物EHP-R和如SEQ ID No.3所示的探针EHP-Pro；

所述检测SHIV的引物探针组合包括如SEQ ID No.4所示的正向引物SHIV-F、如SEQID No.5所示的反向引物SHIV-R和如SEQ ID No.6所示的探针SHIV-Pro。

本发明提供了所述的引物探针组合在制备EHP和SHIV双重实时荧光定量PCR检测试剂中的应用。

本发明提供了一种EHP和SHIV双重实时荧光定量PCR检测试剂盒，包括所述引物探针组合。

优选的，还包括qPCR Probe MasterMix。

优选的，在同一检测体系中，SHIV-F或SHIV-R的终浓度独立为0.4pmol/μL，SHIV-Pro的终浓度为0.2pmol/μL，EHP-F或EHP-R的终浓度独立为0.35pmol/μL，EHP-Pro的终浓度为0.25pmol/μL。

优选的，用于检测EHP和SHIV双重实时荧光定量PCR的扩增程序如下：95℃预变性5min；95℃变性10s，退火温度60℃30s，共40个循环，每个循环结束时进行荧光信号采集。