[发明专利]一种基于液相捕获杂交处理前的混样方法

说明书

本发明公开了一种基于液相捕获杂交处理前的混样方法，针对不同样本起始量、样本类型、探针集大小，包括科研临床NGS常见的游离核酸、新鲜组织、石蜡切片组织、细胞株系、外周血白细胞、胸腹水细胞沉淀样本类型等，减少不同样本类型和相同类型样本间质量存在的差异，保证混样杂交数据量分配平衡，同时，给出最低文库混合进样量，可根据实际需要的测序深度自由调整比例和混样数目，达到优化实验流程和节约成本的目的。

技术领域

本发明涉及基因测序技术领域，特别涉及一种基于液相捕获杂交处理前的混样方法。

背景技术

尽管新一代测序(NGS)的出现让测序成本一降再降，但有时候，整个基因组的测序并不是必需的，甚至会适得其反。相反，将注意力放在其中一小部分，才是明智的。如今，通过靶向富集策略，人们能够减少某些项目的测序量，加快进度并降低成本，同时减轻数据分析的负担。

目标区域捕获是针对感兴趣的特定基因组区域，设计探针富集特定基因组区域，并通过高通量测序技术检测目标区域特定的遗传性突变或者体细胞突变。目标区域测序可用于寻找复杂疾病如癌症、糖尿病、肥胖症等的致病基因和易感基因，为攻克人类的这些疑难杂症提供一种全新的方法。

以外显子组为例，它仅占基因组的1％到2％，但却含有85％的已知致病突变。这么看来，与全基因组测序(WGS)相比，外显子组测序相当于减少了98％的测序工作，不用说，靶向测序集合(panel)更是大大减轻你的负担，其灵活性更高，可以针对自己感兴趣的染色体区域或者大量的候选基因区域进行数百个甚至上千个样品的序列测定；针对性强：更具有针对性，能够直接发现与蛋白质功能变异相关的遗传突变，可以依赖大量的前期研究成果，获得候选染色体区域或者基于生物通路的大量候选基因；数据可靠性高：因测序区域较小，可以通过更高深度测序保障变异检出的准确性；效率高：研究目标更为明确，提高了检测和后期信息学分析的效率。根据探针的状态不同，杂交捕获又因为杂交状况不同分为固态杂交和液态杂交，本发明主要针对液态捕获杂交，其探针存在液相中，探针携带生物素，当探针和目标区域杂交完成后，通过磁珠可以将探针吸附(此时探针有携带目前区段和空探针)，将未被捕获的片段扔掉。之后通过变性可以将探针和目标区段分开，然后利用磁珠将所有空探针吸附丢弃，目标区段捕获完成。

游离核酸、石蜡切片组织、细胞株系、外周血白细胞、胸腹水细胞沉淀等是科研临床NGS常见的分析样本类型，cfDNA游离核酸在存在于血液中，来源于正常细胞，在血液中含量非常低，并且半衰期很短。ctDNA为来源于肿瘤细胞的cfDNA，一般情况下仅占cfDNA总量的0.01-0.2％，并且容易与血浆蛋白结合，因此使用常规的DNA提取试剂盒，提取效率极易不高。一般采用血浆进行cfDNA抽提，以排除凝血过程的影响以及血细胞基因组DNA的污染。石蜡切片组织是指经福尔马林固定石蜡切片的组织样本，细胞株系、外周血白细胞、胸腹水细胞沉淀都包含丰富的基因变异位点信息。

由于不同样本类型和相同类型样本间质量均存在差异，在进行液相杂交时，样本文库混样量计算方法，就显的尤为重要，石蜡切片样本文库间的差异尤为明显，由于固定包埋条件和储存时间长短不同，样本核酸的连接效率、扩增效率存在很大差异，一般来说，在相同实验条件下，新鲜组织的文库转化率要低于游离核酸，略高于细胞株系、外周血白细胞、胸腹水细胞沉淀样本，石蜡切片样本不尽相同，质量好的石蜡切片样本文库转化率可接近新鲜组织，质量差的只有新鲜组织一半，按照常规等量混样方法会导致混样杂交数据量分配不平衡，造成部分样本测序深度不够，进而导致一些突变位点无法被准确检出，需要重复实验，无法有效的控制测序成本和周期。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于液相捕获杂交处理前的混样方法，针对不同样本起始量、样本类型、探针集大小，包括科研临床NGS常见的游离核酸、新鲜组织、石蜡切片组织、细胞株系、外周血白细胞、胸腹水细胞沉淀样本类型等，减少不同样本类型和相同类型样本间质量存在的差异，保证混样杂交数据量分配平衡，同时，给出最低文库混合进样量，可根据实际需要的测序深度自由调整比例和混样数目，达到优化实验流程和节约成本的目的。