[发明专利]一种L-草铵膦化学酶法生产方法

权利要求书

1.一种L-草铵膦化学酶法生产方法，其特征在于，包括以下步骤：以N-苯乙酰-D,L-草铵膦作为底物，使用酰胺酶突变体进行催化合成L-草铵膦，或使用能够表达所述酰胺酶突变体的基因工程菌全菌进行共培养催化合成L-草铵膦，

其中，所述酰胺酶突变体由巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)的酰胺酶基因突变所得，具体突变位点选自以下三种中的一种：

(1)M309V；

(2)M309V/F319Y；

(3)M309V/F319Y/Y442F，

所述的酰胺酶突变体，氨基酸序列如SEQ ID No.2、SEQ ID No.4或SEQ ID No.6所示。

2.如权利要求1所述的L-草铵膦化学酶法生产方法，其特征在于，编码所述酰胺酶突变体的基因，基因序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.3或SEQ ID No.5所示。

3.如权利要求1所述的L-草铵膦化学酶法生产方法，其特征在于，所述N-苯乙酰-D,L-草铵膦的制备方法包括以下步骤：

(1)D,L-草铵膦使用碱液真空加热脱氨；

(2)加入苯乙酰氯在0～5℃下反应生成N-苯乙酰-D,L-草铵膦；

(3)降低pH去除杂质苯乙酸；

(4)使用有机溶剂萃取除杂；

(5)萃取除杂后的水相继续降低pH直到N-苯乙酰-D,L-草铵膦析出，收集析出产物并干燥后获得所述N-苯乙酰-D,L-草铵膦。

4.如权利要求1所述的L-草铵膦化学酶法生产方法，其特征在于，催化合成L-草铵膦后，所述L-草铵膦的纯化方法包括以下步骤：

(1)使用离子交换层析分离提取L-草铵膦，填料选用强酸性阳离子树脂；

(2)上样吸附后，使用纯水冲洗去杂质；

(3)使用氨水作为洗脱液进行洗脱，收集洗脱产物。

5.如权利要求1所述的L-草铵膦化学酶法生产方法，其特征在于，使用酰胺酶突变体进行催化合成L-草铵膦时，将酰胺酶突变体制成固定化酶形式。

6.如权利要求5所述的L-草铵膦化学酶法生产方法，其特征在于，酰胺酶突变体制成固定化酶形式的方法包括以下步骤：利用表达所述酰胺酶突变体的基因工程菌表达所述酰胺酶突变体，然后将表达后的全细胞破碎，离心获取上清液，上清液通过超滤获得酶的浓缩液，取浓缩液添加终浓度为0.5mM的Co²⁺后，添加与浓缩液等体积且浓度为3.0M的硫酸铵溶液，加入浓缩液1/5质量体积比的LX-1000EP(C)树脂固定6小时，抽滤，滤饼用蒸馏水洗涤三次，滤饼在pH 9.5、100mM的磷酸盐缓冲液中添加100mM的苯乙酸和20％的甘油，25℃保温72小时，保温后抽滤，滤饼用蒸馏水洗涤三次，最后滤饼在pH 8.5、3.0M的甘氨酸溶液中，25℃保温24小时，获得固定化酶。

7.如权利要求1所述的L-草铵膦化学酶法生产方法，其特征在于，催化反应完成后，对产物N-苯乙酰-D-草铵膦进行消旋处理，消旋处理方法为：将苯乙酸加热至170℃，然后加入产物N-苯乙酰-D-草铵膦混合，降温至150℃后保温5min，再降温至145℃保持15min后结束反应，获得N-苯乙酰-D,L-草铵膦。