[发明专利]SPRR4蛋白作为胃癌血清生物标志物的应用及其试剂盒

权利要求书

1.一种SPRR4蛋白在制备胃癌血清生物标志物检测试剂盒中的应用，其中胃癌血清生物标志物是SPRR4蛋白的免疫球蛋白G抗体。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述SPRR4蛋白是从经由基因工程改造过的酿酒酵母经半乳糖诱导过量表达，再经琼脂糖亲和介质谷胱甘肽分离纯化而得到。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，试剂盒包括：包被于酶标板上的SPRR4蛋白、0 U/ml的标准血清1、100 U/mL的标准血清2、酶标试剂、酶底物溶液、封闭液、样品稀释液、洗涤液和终止液；

所述酶标试剂的酶标记物为辣根过氧化物酶标记的人免疫球蛋白G抗体。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述酶底物溶液为TMB应用液，包括显色剂A和显色剂B；

所述显色剂A以每500 mL计，包括以下各组分：醋酸钠10.7-14.2g，柠檬酸0.3-1.9g，30%双氧水0.2-0.6mL；

所述显色剂B以每500 mL计，包括以下各组分：TMB200-650 mg，DMSO5-30mL，柠檬酸3.2-7.9 g。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述包被于酶标板上的SPRR4蛋白的制备中，采用的包被缓冲液为0.05 M碳酸盐缓冲液；所述碳酸盐缓冲液包括以下组分：碳酸钠1.59 g/L，碳酸氢钠2.93 g/L；所述碳酸盐缓冲液的pH值为7.4。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述封闭液为含有0.5 %牛血清白蛋白的、浓度为0.01 mol/L 的PBS缓冲液，具体包括：牛血清蛋白BSA 5 g/L、氯化钠8 g/L、氯化钾0.2 g/L、磷酸氢二钾0.2 g/L和十二水合磷酸氢钠2.9 g/L，pH值为7.4。

7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述样品稀释液为0.01 mol/L的PBS缓冲液，具体包括：氯化钾0.2 g/L，氯化钠8 g/L，磷酸氢二钠0.2 g/L，十二水合磷酸氢钠2.9g/L， pH 值为7.4。

8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述洗涤液为0.01 mol/L的PBST磷酸盐缓冲液，具体包括：氯化钾0.2 g/L、氯化钠8 g/L、磷酸氢二钾0.2 g/L、十二水合磷酸氢钠2.9g/L和Tween-20 0.5 mL/L，pH 值为7.4；

所述终止液为2 mol/L 硫酸溶液。

9.一种非诊断目的的基于权利要求3所述试剂盒测定血清中蛋白质SPRR4的免疫球蛋白G抗体浓度的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）包被：将纯化的人蛋白质SPRR4用包被缓冲液稀释至1μg/mL后加入到孔酶标板中，于37℃包被2小时，然后洗涤3次，甩干；

（2）封闭：加入封闭液200μL，室温放置2小时，洗涤3次，甩干；

（3）加样：将0 U/ml标准血清1、100 U/ml标准血清2与待测血清样品各按1:100稀释至100μL后加入到各抗原测定孔板中，晃匀后加盖或覆膜；

（4）温育：酶标板置于37 ℃反应120分钟后甩净孔中液体，不用洗涤；

（5）加酶标记：每孔加辣根过氧化物酶标记的人免疫球蛋白G抗体100 μL，于37 ℃放置60分钟后甩净孔中液体，洗板5次后拍干；

（6）显色：拍干后各孔滴先后加入显色剂A和显色剂B各 50 μL，震荡混匀，于37℃避光放置显色15分钟后，加入终止液50 μL，终止反应；

（7）用酶联仪在450 nm波长依序测量各孔的光密度，然后进行计算，即得血清中抗蛋白质SPRR4的免疫球蛋白G抗体浓度。