[发明专利]一种硅胶骨架表面高密度键合适配体的整体聚合亲和床层及其制备方法

说明书

本发明公开了一种硅胶骨架表面高密度键合适配体的整体聚合亲和床层及其制备方法。本发明采用“sol‑gel”法的制备工艺,制备表面带巯基硅胶杂化整体柱，硅烷化试剂聚合液以溶胶‑凝胶方法制备表面带有巯基基团的高比表面‑(Si‑O‑Si)_n‑刚性结构，在此基础上以纳米金为中间连接媒介，金纳米粒子通过巯基修饰到制备好的硅胶柱表面形成纳米材料功能化桥联作用界面，最后将适配体通过巯基修饰到金纳米粒子表面，实现核酸适配体在有机‑无机硅胶杂化整体聚合床层表面的高密度修饰，应用于赭曲霉毒素A的特异识别。

技术领域

本发明属于整体聚合材料制备领域，具体涉及一种硅胶骨架表面高密度键合适配体的整体聚合亲和床层及其制备方法。

背景技术

亲和色谱是基于样品分子和固定相之间一种特异性相互作用而分离生物分子的现代分离技术。亲和色谱将具有特异性识别功能的基团固载于色谱固定相上，利用所分析物与固定相的特异性和专一性作用实现分析物与样品中其他物质的分离，具有选择性富集目标物的能力而被广泛应用于样品的富集和纯化以及定量定性分析中。

核酸适配体是一种对其目标物质有特异的识别能力和高亲和力的、经过SELEX技术筛选得到的短链DNA或RNA序列。核酸适配体链内某些互补碱基的配对，氢键和范德华力等作用使其可以形成许多稳定的空间结构，如发卡式结构、G-四分体、假结和凸环结构等，这些结构的形成使其与各类靶标分子的结合变得比较容易。核酸适配体具有高亲和力、稳定性好、可体外筛选合成、目标配体范围广等特点受到越来越多的关注。近几年来，以核酸适配体作为亲和配体来分离和分析检测小分子物质和蛋白质等，将核酸适配体修饰到毛细管整体柱固定相内用于分析分离的方法也受到研究者们的高度关注。

目前制备核酸适配体键合毛细管整体柱的方式主要包括以下几个方面：

1.非化学键合核酸适配体法，采用生物素和链霉亲和素法键合适配体法，其是利用一些较强的亲和作用实现适配体键合到固定相上。该制备方法制备条件温和、简单快速、同时产量高，利于保持适配体的活性等。利用该方法生物素修饰后的核酸适配体固定在链霉亲和素微球上，再将修饰后微球填充到石英毛细管中，制备了核酸适配体亲和柱，或者利用生物素与链霉亲和素之间的桥连作用，将适配体修饰到有机聚合物整体柱上，制备了核酸适配体亲和整体柱，可实现对细胞色素C和凝血酶的分离与检测。

2.化学键合核酸适配体法，主要包括巯-烯点击及戊二醛法，其中巯-烯点击法相比硅胶整体柱表面衍生受限于硅羟基间的缩合反应，巯-烯点击反应具有适应范围更广，整体柱表面带有巯基或者烯键、环氧官能团都可以衍生，这个特点大大的拓宽了衍生范围，通过制备或者后续衍生使毛细管整体柱表面带上双键或者环氧基团，通过巯-烯点击法，或者通过一锅煮的方式可将一端修饰巯基的核酸适配体高效的键合到毛细管整体柱表面，制备的核酸适配体亲和整体柱可实现对蛋白的分离纯化和检测。该方法具有反应效率高、快速简便等优点，但该方法制备出的核酸适配体键合密度不高。

金纳米粒子具有较好生物相容性、易修饰性和易制备性，已经被应用到多个不同的领域。金纳米粒子通过巯基或者氨基修饰到整体柱表面，随后巯基适配体通过巯基或者氨基修饰到金纳米粒子表面，可最终实现整体柱表面的高密度的功能化修饰。目前，以纳米金为连接媒介将末端修饰有巯基的核酸适配体固定到表面带有巯基基团的基质整体柱上，制备的核酸适配体修饰的整体柱可对凝血酶进行富集、分离与检测。但是，上述方法制备的杂化硅胶基亲和整体柱中核酸适配体的覆盖密度都在277-342pmol/μL的水平。巯基化杂化整体聚合材料可以通过一步法或者一锅法制备而成，在适当盐溶液环境下，DNA链可以呈现高度分散状态，与DNA水溶液直接反应比较，有助于高密度键合在毛细管整体聚合材料表面，有利于进一步提高其对目标物快速、高效及灵敏的检测。

发明内容