[发明专利]一种利用巨大芽孢杆菌分离提取β－谷甾醇的方法

说明书

本发明公开了一种利用巨大芽孢杆菌分离提取β－谷甾醇的方法，包括以下步骤：粗提物的制备：巨大芽孢杆菌菌体细胞经喷雾干燥制成菌粉备用，质量比为1:3的菌粉与乙醇，在压力为0.04‑0.06MPa、温度为40‑60℃下回流提取3次，时间为每次4h，得巨大芽孢杆菌提取液，减压浓缩至总体积的1/10‑1/5后加等体积的水溶解，水溶液与等体积的乙酸乙酯萃取得上层乙酸乙酯萃取液，再经减压浓缩至乙酸乙酯挥干，得粗提物；常压硅胶柱层析，再次常压硅胶柱层析，第三次常压硅胶柱层析，凝胶柱层析，重结晶。本发明底物廉价易得，工艺简单易行，生产过程环保。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体来说涉及一种利用巨大芽孢杆菌分离提取β－谷甾醇的方法。

背景技术

β-谷甾醇(β-sitosterol)是植物甾醇的主要成分之一，属于四环三帖类化合物，在常温下为白色晶体粉末，无臭无味，熔点可达130—140℃，不溶于水，在一定的有机溶剂中可以溶解，并具有较高的营养价值与生物活性，被广泛应用于医药、食品、保健品及化妆品等领域。近年的研究表明，β-谷甾醇具有明显地降胆固醇、止咳、抗癌、抗炎、抗氧化、防治高血压等药理作用，其分离方法主要有化学法和物理法。化学法存在反应步骤繁琐、操作难度大、成本高且回收率低等缺陷，不能达到理想的分离结果，因而难以实现规模化的工业生产；主要应用的物理法有分子蒸馏法、高效液相法、吸附法、溶剂结晶法等，其中溶剂结晶法具有操作简便、工艺流程短简单、产品纯度高、溶剂易于回收、适合工业化生产等优点，但仅适合溶解度随温度变化不大的物质。

发明内容

本发明的目的在于克服上述缺点而提供的一种底物廉价易得，工艺简单易行，生产过程环保的利用巨大芽孢杆菌分离提取β－谷甾醇的方法。

本发明目的及解决其主要技术问题是采用以下技术方案来实现的：

本发明的一种利用巨大芽孢杆菌分离提取β－谷甾醇的方法，包括以下步骤：

（1）粗提物的制备

巨大芽孢杆菌菌体细胞经喷雾干燥制成菌粉备用，质量比为1:3的菌粉与乙醇，在压力为0.04-0.06MPa、温度为40-60℃下回流提取3次，时间为每次4h，得巨大芽孢杆菌提取液，减压浓缩至总体积的1/10-1/5后加等体积的水溶解，水溶液与等体积的乙酸乙酯萃取得上层乙酸乙酯萃取液，再经减压浓缩至乙酸乙酯挥干，得粗提物；

（2）常压硅胶柱层析

将粗提物用等体积乙酸乙酯溶解后，与40-80目硅胶按体积比为1:1.2拌样，70℃水浴挥干乙酸乙酯后上样，在已制备好的硅胶层析柱上进行常压硅胶柱层析；用100%石油醚，体积比为100%石油醚:乙酸乙酯=100:1、50:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1，乙酸乙酯:甲醇=30:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1，100%甲醇进行梯度洗脱，流速为10-20 mL/min，分段收集洗脱液,通过薄层层析色谱（TLC）分析，Rf值、5%的浓硫酸乙醇溶液和0.8%磷钼酸乙醇溶液显色综合判断，合并相同组分的洗脱液，减压浓缩至有机溶剂挥干，得浓缩液；

（3）再次常压硅胶柱层析

浓缩液进行抑菌活性测定，其中对青枯雷尔氏菌活性抑菌率为75%-85%的浓缩液再次进行常压硅胶柱层析，用100%石油醚，体积比为100%石油醚：乙酸乙酯=30:1、10:1，100%甲醇进行梯度洗脱，收集洗脱液，经TLC色谱和显色分析后合并相同组分的洗脱液，减压浓缩至有机溶剂挥干，得浓缩组分；

（4）第三次常压硅胶柱层析

浓缩组分又再次进行硅胶层析，用100%石油醚，体积比为100%石油醚：乙酸乙酯=5:1、2:1，100%甲醇进行梯度洗脱，收集洗脱液，经TLC色谱和显色分析后合并相同组分的洗脱液，减压浓缩至有机溶剂挥干，得目标粗品；

（5）凝胶柱层析