[发明专利]调味品中酵母菌的检测方法

权利要求书

1.一种调味品中酵母菌的检测方法，其特征在于，包括：采用实时荧光定量PCR检测待检测调味品中酵母菌的特异性基因。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，检测所述特异性基因用到的引物包括如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，探针包括如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法具体包括：

S1，取所述待检测调味品加入到增菌液中进行培养；

S2，提取所述增菌液中的DNA；以及

S3，以所述DNA为模板采用实时荧光定量PCR检测酵母菌的特异性基因。

4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述增菌液为葡萄糖150～300g、酵母粉5～20g、NaCl3～8g和氯霉素0.05～0.1g，加水至1000mL，灭菌。

5.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述培养为28℃，150～200rpm震荡培养20～24h。

6.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所以S1中，所述待检测调味品与所述增菌液的比例为1:7～9，优选为1:9。

7.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述S2具体包括以下步骤：

1)取1mL所述增菌液，8000～10000rpm离心5min，去除上层液体，获得第一菌体沉淀；

2)在所述菌体沉淀中加入80～100mg 100目无菌石英粉，锥形研磨棒研磨至少3min，破碎细胞；向所述菌体沉淀中加入500μL1.2M山梨醇缓冲液、1mg蜗牛酶，37℃水浴1h，12000r/min，离心10min，弃上清，得到第二菌体沉淀；其中，所述山梨醇缓冲液是用0.1M pH7.4的磷酸盐缓冲液配置；

3)向所述第二菌体沉淀中加入100μL裂解液和20μL蛋白酶K，振荡至菌体完全悬浮，55℃水浴45min；

4)加入250μL6mol/L NaCl溶液和等体积的24:1的氯仿：异戊醇混合液，混匀10min后，13000rpm离心5min；

5)取上清加入2倍体积的无水乙醇，颠倒混匀，静置5min后，13000离心5min；

6)废弃上清，用500μL70％乙醇洗涤沉淀，13000rpm离心2min；

7)重复所述步骤6)一次，废弃上清，室温干燥5～10min；加25～50μL无菌水溶解DNA沉淀。

8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述裂解液包括0.5M TE缓冲液pH8.0、1％CTAB、2％巯基乙醇、卵磷脂酶200U，以及体积比为24:1的氯仿：异戊醇混合液。

9.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR的反应程序为预变性95℃1min；40个循环：95℃变性5s，60℃退火40s，收集荧光。