[发明专利]一种农杆菌介导的油菜黑胫病菌的遗传转化方法

说明书

本发明提供了一种农杆菌介导的油菜黑胫病菌的遗传转化方法，属于植物病原真菌遗传转化技术领域，所述方法包括以下步骤：1)将含质粒pCHs‑GFP的农杆菌接种于LB液体培养基中培养，后转入含有150～250μg/mL乙酰丁香酮的CM液体培养基中重悬获得农杆菌菌液；2)收集油菜黑胫病菌的分生孢子与无菌水混合制备浓度为(0.5～9)×10⁶个/mL的分生孢子悬浮液；3)将所述农杆菌菌液与分生孢子悬浮液混合，共培养3～4d后，转移至筛选培养基，筛选培养7～15d获得转化子；所述方法转化效率高、低拷贝、遗传稳定。

技术领域

本发明属于植物病原真菌遗传转化技术领域，尤其涉及一种农杆菌介导的油菜黑胫病菌的遗传转化方法。

背景技术

油菜黑胫病(Phoma stem canker)，目前是制约许多国家油菜产业健康发展的重要因素之一。研究显示，在世界上许多黑胫病流行的油菜产区，病原复合种Leptosphaeriamaculans和Leptosphaeria biglobosa两者共同存在，单独或共同侵染寄主作物，L.maculans可引起油菜茎基部腐烂并造成严重的产量损失。油菜黑胫病在世界各国的扩散趋势及演化规律显示存在L.biglobosa被L.maculans逐渐替代的趋势。1999年，我国首次分离获得病原菌L.biglobosa，且近年来L.biglobosa在我国的发生危害呈逐年扩展蔓延趋势，随着L.biglobosa的扩展蔓延，我国极有可能出现L.maculans，即黑胫病对我国的油菜及十字花科作物安全生产构成了威胁。

为阻止、应对黑胫病给我国的油菜生产造成巨大的经济损失，我们必须明白黑胫病(L.biglobosa)与油菜的互作关系。荧光标记为研究病原微生物与寄主间的相互作用提供了更为直观的手段，利用这种方法能够进行长期的、实时的、直接的观测。而建立油菜黑胫病菌(L.biglobosa)的遗传转化体系，获得带有荧光标记阳性转化子是前提和基础。目前广泛采用的真菌转化方法有质粒共转化、电激转化、基因枪、限制性内切酶介导转化(REMI)和农杆菌介导转化，但质粒共转化、电激转化、基因枪法、限制性内切酶介导转化等转化方法因原生质体制备和再生过程操作繁琐、重复性差而易造成转化子不稳定、转化效率低等问题。虽然电转化法、基因枪法等也可以以孢子和菌丝体为受体，简化了操作步骤，但转化效率较低，且转化子遗传稳定性差。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种转化效率高、低拷贝、遗传稳定的农杆菌介导的油菜黑胫病菌的遗传转化方法。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

一种农杆菌介导的油菜黑胫病菌的遗传转化方法，包括以下步骤：

1)将含质粒pCHs-GFP的农杆菌接种于LB液体培养基中培养至菌液的OD₆₀₀为0.5～0.7后，转入含有150～250μg/mL乙酰丁香酮的CM液体培养基中重悬获得农杆菌菌液；

2)收集油菜黑胫病菌Leptosphaeria biglobosa的分生孢子与无菌水混合制备浓度为(0.5～9)×10⁶个/mL的分生孢子悬浮液；

3)将所述农杆菌菌液与分生孢子悬浮液混合，共培养3～4d后，转移至筛选培养基，筛选培养7～15d获得转化子；

所述质粒pCHs-GFP上包括潮霉素抗性基因、GFP绿色荧光蛋白基因和卡那抗性基因；

步骤1)和步骤2)之间无时间顺序限定。

优选的，步骤1)中所述菌液的OD₆₀₀为0.6。

优选的，步骤1)中所IM液体培养基中乙酰丁香酮的浓度为180～220μg/mL。

优选的，步骤1)所述的LB液体培养基中包括卡那霉素和利福平。