[发明专利]神经元核内包涵体病NOTCH2NLC基因GGC重复扩增检测试剂盒

说明书

本发明提供了一种快速检测NOTCH2NLC基因GGC重复异常扩增的方法及试剂盒。试剂盒成分包括反应溶液、增强剂、特异引物、dNTPs和DNA聚合酶。通过高GC含量PCR体系，GGC重复经高热稳定性和高GC含量模板的DNA聚合酶扩增并进行荧光扫描即可计算出待测样品的GGC重复数目和判断是否发生扩增。本发明的试剂盒通过PCR系统1检测NOTCH2NLC基因GGC的重复数目，确定重复数目属于正常还是突变范围，筛查出受试者是否携带GGC致病突变；通过PCR系统2的梯形峰判断是否存在扩增，避免漏检。该方法可应用于神经元核内包涵体病和部分痴呆患者的基因检测。本试剂盒具有快速、准确、灵敏度高、防漏检等特点。

技术领域

本发明涉及分子生物学诊断领域,具体涉及一种检测神经元核内包涵体病NOTCH2NLC基因GGC重复扩增的方法及试剂盒。

背景技术

神经元核内包涵体病(Neuronal Intranuclear Inclusion Disease，NIID) 是以中枢和外周神经系统以及内脏器官内嗜酸性透明包涵体为特征的一种罕见的多系统慢性进展的神经退行性疾病。NIID的临床表现具有高度异质性，取决于神经元丢失的主要部位而定，主要包括锥体系和锥体外系症状、小脑性共济失调、痴呆、痫性发作、周围神经病和自主神经功能障碍等。多数少年发病，少数中年发病，家族性常见。一般发病10-20年后死亡。

第一例NIID由Lindenderg等人在1968年报道，1例精神发育迟缓、进行性痉挛、共济失调的男性患者，脑和内脏细胞发现核内包涵体。后续欧美和日本等地相继报道了NIID100余例，发病年龄从婴儿、少年、成年至68岁。NIID 的临床表型异质性非常高,主要表现痴呆、自主神经、周围神经、锥体外系、小脑以及精神行为异常等症状。以往确证需要通过尸检、直肠活检、神经活检等，现在主要通过皮肤活检是否存在嗜酸性核内包涵体来确诊。影像学检查DWI 的特征性皮质-髓质交界处高信号可疑诊为NIID。目前该病尚无明确规范的诊断标准，皮肤活检显示嗜酸性核内包涵体即为确诊。但由于患者配合度等原因，诊断困难，非常容易发生漏诊和误诊。

NOTCH2NLC位于1q21.1，是人类特有的三个NOTCH2NL基因(NOTCH2NLA、 NOTCH2NLB和NOTCH2NLC)其中之一。它在包括神经胶质细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞在内的多种神经细胞中高度表达。NOTCH2NL基因参与了人类大脑皮层的快速进化，解释了人类与其他灵长类动物相比大脑皮层扩增的原因。 NOTCH2NL基因间具有极高度的序列相似性，且多为GC-rich区域，二代测序发等方法很难进行序列进行分析和检测。

NOTCH2NLC基因(NM_001364012)的5’UTR区域存在一段GGC的重复序列，正常人不会发生扩增，但是神经元核内包涵体病患者均存在GGC重复序列的扩增。正常人GGC重复数目几乎都小于40,目前检测到致病的最低GGC重复数为 66个。最新研究表明家族性和散发的NIID都是由于NOTCH2NLC基因的GGC重复扩增引起的，还有一部分痴呆患者也可能是由于该基因的GGC重复异常扩增引起。对于神经元核内包涵体病，基因检测势必将取代皮肤活检成为诊断金标准。

对于多核苷酸重复的检测方法通常为直接对多核苷酸重复片段进行PCR扩增，随后利用毛细管电泳对扩增片段长度进行检测，从而确定核苷酸重复的数目。但是NIID患者NOTCH2NLC的GGC重复扩增数高，普通PCR难以检测这种大片段且高GC含量的动态突变。Southern blot虽然可以用于较大片段重复序列的检测，但是实验需要较多高质量DNA，且实验技术复杂、成本高、周期长，很难在临床上推广应用。异常扩增片段长且GC含量高，需要特异的方法进行检测。由于高GC序列扩增的困难性，实验室难以进行该检测，也没有公司推出相应产品，如果操作不当，极易发生误诊或漏诊。

发明内容

本发明提供一种用于检测NOTCH2NLC基因GGC重复数目的试剂盒。

为了实现发明目的，我们采用了以下技术方案：