[发明专利]一种可实用于大规模鸽子性别鉴定的基因识别优化方法

权利要求书

1.一种可实用于大规模鸽子性别鉴定的基因识别方法，其特征在于采集受检鸽的静脉血样、血样的前处理、处理后样品的再编号规范、处理后样品基因组DNA模板的制备、和制备的模板直接用于PCR的直接扩增。

2.如权利要求1所述的特征，受检鸽的血样采集的是静脉血，采集量为1-20μl，优选1μl。

3.如权利要求1所述的特征，将采集的血液转移至内装有10-100μl溶液A的1.5ml小塑料离心管中。优选20μl。以记号笔在塑料离心管盖上书写血样对应鸽子的唯一编号。优选以两位阿拉伯数字编号(00至96)；每96个样品为一盒或一袋；每盒或每袋另行编号，优选以英文26个字母编号。血样的前处理是将1.5ml塑料管插入到塑料泡沫垫上，然后转移至沸水中孵育。沸水的温度为90℃以上，优选95℃；孵育时间为5-15分钟，优选10分钟。热处理后的样品迅速转移至冰上保存。

4.如权利要求3所述的特征，溶液A的成分是低渗液，其盐离子(氯化纳)含量范围是0至0.1％。

5.如权利要求3所述的特征，经预处理的样品在用作模板前将快速离心，以便将样品集中至EP管底部(此时EP管底部可见黑或紫色沉淀)。

6.如权利要求1所述的特征，处理后样品的再编号规范是通过优先编号未来用于PCR扩增的PCR管顺序来间接实现的。具体地，先以一个8联PCR管为一行顺序进行排列，以12行为一组(共96个样)。每一行确认从左到右的方向，对应的列依次(自左向右)编号为A、B、C、D、E、F、G、H(共8列)。12行确认从上到下的方向，行的编号(自上而下)顺序为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12(共12行)。8联管每管的编号即将作为未来样品的编号方式。

7.如权利要求6所述的特征，将所有已编号的PCR管中分别加入0.5-2.0μl的一步法溶液(南京尧顺禹生物科技公司产品)(优选1.5μl)，然后将经快速离心至管底的黑或紫色沉淀(如权利要求5所述)挑选部分转移至已编号且已加入1.5μl的一步法溶液(南京尧顺禹生物科技公司产品)的8联管中，对应的待性别鉴定的鸽子样品按8联管的编号进行排列，以8联管的编号作为待鉴定鸽子的新编号。

8.如权利要求1所述的特征，处理后样品基因组DNA模板的制备方法是将权利要求7所获得的样品盖上PCR管盖后快速离心，然后将PCR管按序转移至PCR仪中，按孵育、变性、和保存的程序进行处理。其中孵育温度是50-65℃，优选65℃；孵育时间是10-45分种，优选30分钟；变性温度是85-100℃；优选95℃；变性时间是2-30分钟，优选5分钟；保存温度是4-16℃，优选16℃。保存时间为1分钟-12小时，优选1分钟。

9.如权利要求1所述的特征，PCR直接扩增的方法是将按常规方法准备的PCR反应液(含1×PCR Mastermix和扩增引物各0.25μM(正向引物的序列为gatccagtgcttgtttcc和反向引物序列aacgtggcaacagagtac)9.5μl直接加入到如权利要求8所制备的鸽样基因组DNA模板溶液内。然后直接进行PCR反应。反应条件为：95℃ 2min；30×(95℃ 30s，56℃ 30s，72℃40s)；72℃ 10min；16℃储存。