[发明专利]一种小鼠精子冻存液及其制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种小鼠精子冻存液及其制备方法和应用，属于体外受精技术领域。一种小鼠精子冻存液，包括独立分装的迷迭香酸母液和基础液；所述基础液为包含质量浓度16～20％棉子糖和质量浓度2～4％脱脂奶粉的水溶液；所述迷迭香酸母液的溶剂为所述基础液。使用时将所述小鼠精子冻存液混合配制成含20～50mmol/L迷迭香酸的工作液。在精子冻存液中含有迷迭香酸，用于抗击冻存‑复苏过程中产生的过多活性氧，优化精子的生命代谢过程，增强免疫功能和抗氧化功能，达到保护精子受精的能力的作用，从而提高小鼠精子体外受精率。

技术领域

本发明属于体外受精技术领域，具体涉及一种小鼠精子冻存液及其制备方法和应用。

背景技术

由于生物医学研究的需要，在实验过程中，常常需要制备或从国外进口基因修饰小鼠，但制备或进口的小鼠由于技术难度大、价格高，得到小鼠的数量有限，而用于科学实验的小鼠需要达到具有一定统计学意义的数量才能进行，由于自然繁殖的周期长，采用精子冻存，多次实施体外受精的方法可以很快得到足够数量的小鼠用于实验；科研工作结束后，这些小鼠往往会被采取安乐死，使得资源消失。目前，采取精子冻存的方式，可以保存资源；同时，小鼠在生殖器外伤或濒临死亡的情况下，也可以采取精子冻存的方式保存该资源；保存冻存的精子，还可以进行反复多次的体外受精操作完成小鼠的微生物学净化。谷氨酰胺溶液具有增强免疫和抗氧化功能，常作为传统的小鼠精子冻存液用于近交系小鼠或基因工程小鼠，但其对小鼠精子的保护能力有待进一步提高。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种提高小鼠体外受精率的小鼠精子冻存液及其制备方法和应用。

本发明提供了一种小鼠精子冻存液，包括独立分装的迷迭香酸母液和基础液；所述基础液为包含质量浓度16～20％棉子糖和质量浓度2～4％脱脂奶粉的水溶液；所述迷迭香酸母液的溶剂为所述基础液。

优选的，所述基础液为包含质量浓度18％棉子糖和质量浓度3％脱脂奶粉的水溶液。

优选的，所述迷迭香酸母液的浓度为100mmol/L。

优选的，所述小鼠精子冻存液的工作液为含20～50mmol/L迷迭香酸的基础液。

优选的，所述小鼠精子冻存液的工作液为含30～40mmol/L迷迭香酸的基础液。

本发明提供了一种所述小鼠精子冻存液的制备方法，包括以下步骤：

1)棉子糖、脱脂奶粉和水混合，除菌，每990μL分装一管，得到基础液；

2)用所述基础液将迷迭香酸配成100mmol/L浓度的迷迭香酸母液，每10μL分装一管，得到迷迭香酸母液。

优选的，当配制小鼠精子冻存液的工作液时，将每管所述基础液弃去10×(n-1)μL基础液后与n管迷迭香酸母液混合，制备得到迷迭香酸浓度为10×nmmol/L的小鼠精子冻存液的工作液；其中n＝2～5。

优选的，步骤1)中所述除菌为滤膜过滤除菌；所述滤膜的孔径为0.22μm。

本发明提供了所述小鼠精子冻存液或所述制备方法制备的小鼠精子冻存液在小鼠精子冷冻保存中的应用。

优选的，所述小鼠精子冷冻保存的方法包括以下步骤：

A.将小鼠精子冻存液配制成小鼠精子冻存液的工作液，平衡至37～39℃，得到预热的工作液；

B.将待精子冷冻的小鼠处死后，取出附睾尾，剪碎，得到附睾尾碎片；

C.将所述附睾尾碎片和所述预热的工作液混合，分离精子，将含有精子的工作液预冷后，保存至液氮中。