[发明专利]一种利用生物发光报告系统判定抗生素作用机制的方法

权利要求书

1.一种利用生物发光报告系统判定抗生素作用机制的方法，步骤是：

(1)使用生物发光报告系统制备金黄色葡萄球菌lux报告株；其中，所述发光报告系统由pAmilux-clpX-luxABCDE质粒、pAmilux-dnaJ-luxABCDE质粒、pAmilux-dnaK-luxABCDE质粒、pAmilux-groE-luxABCDE质粒组成；所述pAmilux-clpX-luxABCDE质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述pAmilux-dnaJ-luxABCDE质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述pAmilux-dnaK-luxABCDE质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述pAmilux-groE-luxABCDE质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；所述金黄色葡萄球菌lux报告株是由四种质粒pAmilux-clpX-luxABCDE质粒、pAmilux-dnaJ-luxABCDE质粒、pAmilux-dnaK-luxABCDE质粒、pAmilux-groE-luxABCDE质粒分别转化入金黄色葡萄球菌中，制成的四株金黄色葡萄球菌报告株，分别命名为：报告菌株S1、报告菌株S2、报告菌株S3、报告菌株S4；

(2)制备含有四株金黄色葡萄球菌报告株的琼脂糖双层平板，将灭菌的滤纸片在琼脂糖双层平板中央或培养基表面有序排布并与培养基紧密相贴；

(3)将待检含有抗生素的溶液滴加到滤纸片上，继续培养并拍摄细菌发光图片；

(4)将发光图片转化为发光曲线，提取发光曲线特征同已知抗生素特征发光曲线比对进行层级聚类，若所检测抗生素发光曲线和已知作用机制的抗生素的发光曲线聚类在一起，则判定待检的抗生素作用机制与已知作用机制的抗生素相同。

2.如权利要求1所述利用生物发光报告系统判定抗生素作用机制的方法，其特征在于：步骤(2)所述滤纸片是用打孔器将新华1号定性滤纸打成直径6mm的圆形小纸片。

3.如权利要求1所述利用生物发光报告系统判定抗生素作用机制的方法，其特征在于：步骤(3)所述将待检含有抗生素的溶液滴加到滤纸片上以后，将平板倒置于培养箱中，37℃培养20～25h。

4.如权利要求1所述利用生物发光报告系统判定抗生素作用机制的方法，其特征在于，步骤(4)所述将发光图片转化为发光曲线或已知抗生素特征发光曲线的绘制方法是：

1)以平板中心为原点(x0,y0)，将平板半径等分为300或1200份的特定份数，所得到的每个圆环中平均距离记为其中点到原点的最大距离和最小距离的平均值d；

2)设A为某个圆环中所有点的平均发光强度，则平均发光强度为d的函数：A＝f(d)；

3)应用设定的函数绘制成发光曲线。

5.如权利要求1或4所述利用生物发光报告系统判定抗生素作用机制的方法，其特征在于，所述已知抗生素是达托霉素(DAP)，多粘菌素B(PMB)，亚胺培南(IPM)，青霉素G(PEN)，万古霉素(VAN)，红霉素(ERY)，卡那霉素(KAN)，壮观霉素(SPE)，链霉素(STR)，四环素(TET)，丝裂霉素C(MMC)，环丙沙星(CIP)，加替沙星(GAT)，甲氧苄啶(TMP)，利福平(RIF)，腐草霉素(PHL)。

6.如权利要求1所述利用生物发光报告系统判定抗生素作用机制的方法，其特征在于，步骤(4)依据特征发光曲线进行层级聚类分析的方法是：

1)将每个从抑菌圈边缘到平板边缘部分的特征发光曲线记为由300个发光强度所表征的一个向量，每一个发光强度代表发光图片中从抑菌圈边缘到平板边缘部分每个圆环即抑菌圈边缘到平板边缘部分1/300的圆环中的平均发光强度；

2)将每一个抗生素所对应的生物发光系统中四株金黄色葡萄球菌报告株的特征发光曲线合并成一个由1200个发光强度所表征的合并发光强度表征向量；

3)使用欧几里得距离计算方法，计算抗生素的合并发光强度表征向量之间的距离，并构建抗生素的距离矩阵；

4)使用R语言中的hclust函数，用UPGMA算法，对抗生素的合并发光强度表征向量之间进行聚类分析，根据待检的抗生素是否同已知作用机制的抗生素聚类在一起判断其抗生素作用机制的类型。