[发明专利]一种基于肝脏代谢组学研究硒化氨基多糖对黑鲷免疫机制增强模型的构建方法

权利要求书

1.一种基于肝脏代谢组学研究硒化氨基多糖对黑鲷免疫机制增强模型的构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1）将用于动物实验的黑鲷幼鱼随机均分为实验组和空白组；

2）采用相同的饲料饲喂实验组和空白组，并在实验组的饲料中加入硒化氨基多糖；

3）饲喂结束后将实验组和空白组的黑鲷幼鱼进行饥饿处理，并用麻醉剂麻醉后，取出肝脏组织，保存备用；

4）制备肝脏组织样品和质控样品，随后使用超高效液相色谱- TripleTOF^TM 5600+联用技术进行处理，进样时质控样品穿插于肝脏组织样品之间；使用超高效液相色谱-TripleTOF^TM 5600+联用技术进行处理的具体方法为：将肝脏组织样品经微孔滤膜过滤之后，在固定的色谱条件和质谱条件下，进入超高效液相色谱-质谱联用仪分析，其中，在液相色谱中C₁₈和HILIC两种色谱柱结合使用，并且，在检测过程中，每隔相同数量的肝脏组织样品插入一个质控样品进行检测分析，以监控检测稳定性；

C₁₈色谱柱色谱条件为：流速：0.3ml/min，进样盘温度：4℃，柱温：40℃，流动相A为2mmol/L甲酸铵和0.05%甲酸水溶液，流动相B为乙腈和间苯二甲酸混合液，且乙腈和间苯二甲酸的体积比为1:1，进样量：2µL，流动相梯度洗脱如下表所示：

序号	时间（min）	A（%）	B（%）
1	0.01	95	5
2	1	95	5
3	5	30	70
4	14	10	90
5	16	0	100
6	20	0	100
7	20.1	95	5
8	25	stop	stop

HILIC色谱柱色谱条件为：流速：0.3ml/min，进样盘温度：4℃，柱温：45℃，流动相C为10mmol/L甲酸铵和0.1%甲酸水溶液，流动相D为乙腈水溶液，其中乙腈和水体积比为95:5，且水中含有10mmol/L甲酸铵和0.1%甲酸，进样量：1µL，流动相梯度洗脱如下表所示：

序号	时间（min）	C（%）	D（%）
1	2	0	100
2	11	55	45
3	12	55	45
4	12.1	0	100
5	17	stop	stop

5）对超高效液相色谱- TripleTOF^TM 5600+联用技术所收集得到的黑鲷肝脏代谢组学数据进行分析处理，识别并筛选出关于硒化氨基多糖对黑鲷免疫机制增强的肝脏代谢组学生物标志物，并对肝脏代谢组学生物标志物指向的代谢通路进行构建和分析；

关于硒化氨基多糖对黑鲷免疫机制增强的肝脏代谢组学生物标志物共有32个，分别为：L-组氨酸、二甲基甘氨酸、4-胍基丁酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、琥珀酸、腺嘌呤、腺苷、脱氧肌苷、肌苷、脱氧鸟苷、鸟苷、甜菜碱、L-蛋氨酸、甘油酸、L-脯氨酸、L-苏氨酸、L-谷氨酰胺、L-丝氨酸、腺苷一磷酸、脱氧腺苷一磷酸、γ-氨基丁酸、L-谷氨酸、D-核酮糖5-磷酸、鸟苷一磷酸、鸟氨酸、L-精氨酸、肌酸、精氨基琥珀酸；

生物标志物主要指向7条代谢通路，分别为：氨酰基-tRNA生物合成、缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸的生物合成、精氨酸和脯氨酸代谢、嘌呤代谢、氮代谢、甘氨酸，丝氨酸和苏氨酸代谢、丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢。