[发明专利]日本血吸虫W染色体特异基因的筛选及其在尾蚴性别鉴定中的应用

说明书

本发明公开了一种日本血吸虫W染色体特异基因的筛选及其在尾蚴性别鉴定中的应用，具体为采用包含日本血吸虫W染色体特异基因的特异引物和日本血吸虫内参基因PSMD4引物的双重PCR方法，属于生物技术领域。本发明以日本血吸虫W染色体特异基因引物和PSMD4看家基因引物，采用双重PCR方法快速鉴定日本血吸虫尾蚴性别，全过程仅需2小时，较传统的动物实验鉴定方法大幅缩短了鉴定时间，提高了日本血吸虫病动物模型的标准化和均一化；同时，本发明无需提取尾蚴DNA，较传统的PCR方法操作简便快捷，重复性高，可实现高通量鉴定；本发明既可以鉴定阳性钉螺释放的单一雌性或雄性尾蚴，又可以鉴定阳性钉螺释放的雌雄混合性别尾蚴。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及日本血吸虫W染色体特异基因的筛选及其在尾蚴性别鉴定中的应用。

背景技术

血吸虫是一种独特的雌雄异体吸虫，染色体包括7对常染色体和1对性染色体，其中雄性性染色体为ZZ型，雌性性染色体为ZW型。日本血吸虫、曼氏血吸虫和埃及血吸虫是最主要的三种人血吸虫病的病原体。血吸虫单性雌虫在宿主体内无法发育成熟，其性成熟依赖于与雄虫的合抱，而成熟雌虫所产生的大量虫卵是造成宿主病理损害和疾病再传播的关键。研发血吸虫尾蚴性别快速鉴定技术有助于单一性别血吸虫感染动物模型建立，对血吸虫遗传进化、发育及生殖机制研究具有重要意义。

血吸虫生活史包括虫卵、毛蚴、母包蚴、子包蚴、尾蚴、童虫及成虫等多个发育阶段，其中仅成虫阶段具有明显的性别二态性，其他发育阶段难以通过虫体形态结构差异进行性别鉴定。传统的动物实验鉴定尾蚴性别方法是将单只阳性钉螺释放的尾蚴通过人工感染实验小鼠，待虫体在小鼠体内发育至成虫(至少需要培养约1个月时间)后进行解剖取虫，通过成虫形态结构差异鉴定感染尾蚴的性别。该方法费时费力，无法满足快速鉴定尾蚴性别的需求。

随着分子生物学技术的发展，国外学者从曼氏血吸虫基因组中筛选获得D9、W1、W2和W6等多条W染色体特异的核酸序列，并以此为基础设计了特异的DNA探针和引物，通过Southern杂交或PCR建立了曼氏血吸虫尾蚴性别鉴定方法。但遗憾的是，已报道的曼氏血吸虫尾蚴性别鉴定方法对不同地理株来源的曼氏血吸虫尾蚴性别鉴定结果并不稳定，且曼氏血吸虫性别特异探针和引物也无法用于日本血吸虫和埃及血吸虫尾蚴性别鉴定。

虽然传统的PCR鉴定尾蚴性别方法比动物实验鉴定尾蚴性别方法所需时间大大缩短，但仍存在许多问题需要进一步解决。首先，传统PCR鉴定尾蚴性别方法需要提取多条尾蚴DNA作为模板进行特异核酸序列扩增，操作繁琐且有引入模板污染的可能性。同时，由于PCR体系中只有一对雌虫特异性扩增区域设计引物，对于扩增出目的条带的样本，无法确认该样本即为单雌性尾蚴，还必须排出雌性尾蚴和雄性尾蚴混合感染的情况；对于没有扩增出目的条带的样本，亦无法确定样本即为雄性尾蚴，还必须排除样本DNA提取失败的可能性。

随着高通量测序技术的发展，日本血吸虫、曼氏血吸虫和埃及血吸虫的转录组和基因组相继获得破译，为科研人员研究血吸虫及血吸虫病提供了丰富的信息资源。然而，日本血吸虫基因组目前尚未组装到染色体水平，无法仅凭基因组序列筛选出W染色体特异的核酸序列或基因。目前，有关日本血吸虫尾蚴性别鉴定的分子生物学方法鲜有报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种日本血吸虫W染色体特异基因的筛选方法。

本发明的另一目的是提供一种日本血吸虫W染色体特异基因在尾蚴性别鉴定中的应用方法。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

首先我们利用Microarray技术初筛出日本血吸虫雌虫特异表达基因并结合生物信息学分析进一步筛选出候选基因进行PCR验证；根据候选基因序列设计特异引物，以雌性成虫和雄性成虫的cDNA和基因组DNA为模板，通过PCR方法最终筛选出日本血吸虫W染色体特异基因。