[发明专利]一种新酶菌株和酶催化剂的制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种新酶菌株和酶催化剂的制备方法和应用，该催化剂可以在很温和的条件下将NB‑7转化为手性醇中间体，反应转化率可达90%甚至95%往上，产物的手性纯度值可达90%（针对不同的手性转化会有不一样的催化剂），甚至还可以让纯度达到95%往上，几乎没有副产物，而且反应时间可以控制在24小时以内，有很好的工业应用背景，使得奈必洛尔手性醇中间体的制备简易化，步骤也不复杂，而且能够大大降低环境污染。

技术领域

本发明涉及一种酮还原酶涉及用于奈必洛尔手性醇中间体及类似物生产的新型应用，属于生物酶工程和微生物应用领域，具体涉及一种新酶菌株和酶催化剂的制备方法和应用。

背景技术

盐酸奈必洛尔【nebivolol hydrochloride， 双[2-(6-氟苯并二氢吡喃-2-基)-2-羟基乙基]胺盐酸盐】是由美国强生公司研发，是一种血管扩张活性的选择性β1肾上腺素受体拮抗剂，用于轻至中度高血压病人的治疗，亦可用于心绞痛和充血性心力衰竭的治疗，具有疗效显著、服用方便、不良反应小等特点。2016年全球销售额9.3亿美元，2017年全球销售额11.3亿美元。

盐酸奈必洛尔分子结构式

奈必诺尔具有16种手性对映异构体，研究发现以（S,R,R,R）疗效最佳，因而NB-8(S,S)/NB-8(R,S)/NB-8(R,R)/NB-8(S,R)四种构型手性醇中间体的制备是盐酸奈必洛尔合成的关键步骤。

目前S-手性醇中间体的合成主要有化学合成和酶法合成两种途径。化学合成采用化学拆分和化学不对称合成来制备手性中间体，这两种方法均存在诸多问题，如化学拆分需要使用大量的拆分剂，反应步骤长，能耗高以及废物排放量大等；基于过渡金属手性配体催化氢化体系，存在着产品光学纯度不高以及重金属残留等问题，导致收率过低，成本居高不下。盐酸奈必洛尔的专利将在2020年到期，原料药价格会一再下探，传统化学合成途径因环保和成本问题受到极大冲击。

酶法合成手性醇中间体的研究报道较少。起初是利用脂肪酶代替过渡金属催化剂来进行手性拆分，虽然污染大为减少，但也存在拆分效率低、另一对映体无法利用等问题。后续研究利用酮还原酶来进行手性还原制备手性醇中间体。然而国内目前还未有可用于工业化生产的酶及其突变体的研究报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种来源于赤红球菌菌属Rhodococcus ruber的酮还原酶Lk Kred基因，并提供该酶体外异源表达体系的构建方法，以及该酶作为生物催化剂用于制备奈必洛尔手性中间体及其类似物的方法。

酮还原酶Lk Kred的核苷酸序列如附件所示。该基因编码的蛋白质的氨基酸序列为附件所示。

一种新酶菌株的制备方法，具体步骤为：

步骤一：在酮还原酶Lk Kred、葡萄糖脱氢酶(BsGDH)、醇脱氢酶(TbADH)基因编码两端分别添加NdeI和HindIII限制性内切酶位点；

步骤二：在表达载体的基因编码两端添加NdeI和HindIII限制性内切酶位点；

步骤三：将步骤一中经过双酶切的Lk Kred与步骤二中双酶切的表达载体进行连接、转化和筛选，筛选得到的阳性质粒；

步骤四：将步骤三中的阳性质粒转入宿主菌中，得到三种新酶菌株。

作为进一步的改进，其特征在于：所述步骤二中的表达载体为pET 或者pCW 或者pUC 或者pPIC9k。