[发明专利]高效利用木糖和葡萄糖的酿酒酵母重组菌的构建及应用

说明书

本发明公开了高效利用木糖和葡萄糖的酿酒酵母重组菌的构建及应用，在酿酒酵母木糖代谢菌株中分别过表达内源噻唑合酶THI4或木酮糖还原酶XYL2。该高效利用木糖和葡萄糖的酿酒酵母重组菌的构建及应用，在过表达来源于热带假丝酵母的木糖还原酶XR(由XYL1编码)和木糖醇脱氢酶XDH(由XYL2编码)的过表达质粒pYX212‑XR‑XDH的基础上，进一步过表达酿酒酵母BY4741内源噻唑合酶THI4或木酮糖还原酶XYL2，转化单倍体酿酒酵母BY4741及二倍体酿酒酵母Kyokai No.6。该方法应用常用组成型高拷贝质粒pYX212，能够实现在混糖发酵过程中提高木糖、葡萄糖共利用过程中碳源的消耗速率和乙醇产量。

技术领域

本发明涉及微生物、分子生物学技术领域，具体为高效利用木糖和葡萄糖的酿酒酵母重组菌的构建及应用。

背景技术

酿酒酵母是工业化产乙醇的首选微生物，而酿酒酵母本身不能利用木糖。对酿酒酵母代谢木糖进行的研究主要集中在对细菌和真菌木糖利用基因的表达和对磷酸戊糖途径的操作上。微生物中木糖代谢的途径有三条，但是目前仅有两条被引入酿酒酵母中。其中一条是木糖异构酶(XI)途径。编码XI的基因广泛存在于细菌中，XI能将木糖直接转化为木酮糖。尽管XI途径不需要辅因子，但是许多细菌的XI(由xylA编码)在酿酒酵母中表达后都没有活性。这可以归因于许多原因，包括蛋白错误折叠、翻译后错误修饰、二硫键形成错误、内部pH不适和特定金属离子缺失。进一步的研究发现，一些厌氧真菌和一些细菌(比如粪便拟杆菌)中的XI能在酿酒酵母中功能性表达使其具有代谢木糖的能力。

另一条是木糖还原酶(XR)-木糖醇脱氢酶(XDH)途径。丝状真菌和一些酵母通过一个包含两步反应的氧化还原途径来代谢木糖。首先，由XYL1编码的XR将木糖还原成木糖醇；然后，由XYL2编码的XDH将木糖醇氧化成木酮糖。现有的研究中，XYL1和XYL2基因多来源于树干毕赤酵母，能够帮助酿酒酵母将木糖转变成木酮糖。但是XR偏好NADPH，XDH严格依赖NAD+。有研究对现有报道中分别引入这两种途径所得到的效果最好的两株菌进行了比较，发现以乙醇为目标产物时，和引入XI途径的重组菌株相比，引入XR-XDH途径的重组菌株的木糖消耗速率和乙醇浓度较高，但是因为会积累木糖醇，所以乙醇产率较低。

造成XR-XDH菌株积累木糖醇、乙醇产率低的主要原因之一是XR、XDH辅因子依赖性不同造成的辅因子不平衡，因为辅因子参与胞内大量代谢反应，辅因子浓度的改变，会对代谢产生广泛的影响。辅因子可以分为ATP/ADP、氧化还原辅因子以及官能团载体等。所有生物体系都需要氧化还原稳态来维持生长和代谢。氧化还原辅因子参与大量生物合成反应，在维持胞内氧化还原平衡方面起着关键作用。其中，NADH/NAD+主要参与分解代谢中的生物氧化还原反应，而NADPH/NADP+是生物合成代谢反应中的调节子。因此，辅因子依赖性不同的XR、XDH的引入会使重组菌株面临氧化还原的不平衡，进而整体代谢受到影响。为此，学者们针对引入XR-XDH途径的重组菌株胞内辅因子水平的调节开展了很多研究，他们采取的方法主要可以分为利用定点突变技术改变XR或者XDH的辅因子依赖性，和改变辅因子相关酶的表达量来进行调节两种。

现有的很多对XR或XDH进行定点突变的研究也结合了关键酶表达量的调节，从而获得更好的效果。因此，基于辅因子调节，从代谢和转录层面深入分析差异途径和基因，再以分析结果指导分子改造，并进一步分析调控机制，是构建高效重组菌株、阐明调控机制的有效途径。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了高效利用木糖和葡萄糖的酿酒酵母重组菌的构建及应用，解决了上述背景技术中提出的问题。

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：高效利用木糖和葡萄糖的酿酒酵母重组菌，在酿酒酵母木糖代谢菌株中分别过表达内源噻唑合酶THI4或木酮糖还原酶XYL2，具体为，在导入了来源于热带假丝酵母的木糖还原酶XR和木糖醇脱氢酶XDH的质粒上进一步过表达S.cerevisiae BY4741内源噻唑合酶THI4或木酮糖还原酶XYL2，转化宿主菌株。