[发明专利]一种牛樟芝发酵耦合萃取生产4-Acetylantroquinonol B的方法

说明书

本发明提供一种牛樟芝深层液体发酵耦合萃取生产4‑乙酰基安卓奎诺尔B(4‑Acetylantroquinonol B)的方法，包括如下步骤：(1)菌种的扩大培养；(2)孢子悬液的制备；(3)牛樟芝液体种子培养；(4)牛樟芝液体发酵培养；(5)产物的提取。本方法使用液‑液提取，与传统固‑液提取法相比，省去了物理方法处理干菌体的各种步骤，实现了生产过程中的节能要求。利用本方法从牛樟芝发酵液中获得了较高产量的活性物质4‑Acetylantroquinonol B。

技术领域

本发明属于生物发酵技术领域，具体涉及一种牛樟芝深层液体发酵耦合萃取生产4-乙酰基安卓奎诺尔B(4-Acetylantroquinonol B)的方法。

背景技术

牛樟芝是中国国台湾地区的特有真菌，其分属于担子菌门，伞菌纲，多孔菌目，拟层孔菌科。牛樟芝子实体仅仅生长在我中国台湾地区海拔数百米甚至几千米的的丛林山地中，并且只寄生在牛樟树的树腔内壁。外形呈板形、钟形、马蹄形或是不规则形状，多年生、无柄，紧贴于木材表面生长。之前的研究中已经对牛樟芝子实体的活性成分及其药理活性进行研究，主要有三萜类化合物，活性多糖，腺苷等多种活性成分。

近年来，从牛樟芝子实体中又分离出4-Acetylantroquinonol B等泛醌类化合物，有保肝，健肝，抗癌等功效。Yu-wei Lin已经证实4-乙酰基安卓奎诺尔B对肝癌细胞HepG2有极强的抑制作用，Yu等人研究表明4-acetylantroquinonol B对胰腺癌(PANC-1、AsPC-1)的生长具有显著的抑制作用，其抑制效果与其含量正相关。4-acetylantroquinonol B同时具有可以降低癌细胞的抗药性，是一种极具潜力的抗癌新药。

由于牛樟芝具有严格的寄主特性，造成牛樟芝的自然产量处于一个极低的水平。因此，牛樟芝子实体的价格十分昂贵，一直处于供不应求的市场状态。所以利用现代生物发酵技术人工培养牛樟芝的菌体成分是解决这一矛盾的途径。Yu-Wei Lin和Been-HuangChiang从液体发酵培养的菌丝体中分离出了4-Acetylantroquinonol B，同时发现在牛樟芝深层液体发酵的培养过程中加入TMBA等物质可以提高4-Acetylantroquinonol B的产量，最终产量为0.8mg/g，仍处于较低水平。对于牛樟芝液态发酵法生产4-Acetylantroquinonol B的报道很少，研究仍处于初级阶段。CN105463038公布了一种在不添加诱导物和前提物的情况下从牛樟芝液体发酵所获得的菌体中获得4-Acetylantroquinonol B的方法，其产量达2.6-5mg/g。但由于发酵提取方法所限，目前从发酵菌体中获取4-Acetylantroquinonol B的产量仍不理想。

发明内容

本发明目的是克服现有技术产量低的不足，提供一种利用牛樟芝菌丝体发酵耦合萃取获得高产量活性物质4-乙酰基安卓奎诺尔B(4-Acetylantroquinonol B)的新方法。

本发明为了实现上述目的而采取如下技术方案：

一种发酵耦合萃取生产4-Acetylantroquinonol B的方法，包括如下步骤：

(1)菌种的扩大培养：通过挖块接种的方式将牛樟芝菌接种至新固体培养基中，进行扩大培养，直至新牛樟芝菌落的形成；

(2)孢子悬液的制备：将无菌水倒入新固体培养基中，用玻璃棒刮下孢子，得到孢子悬液；

(3)牛樟芝液体种子培养：将孢子悬液接种至液体种子培养基中，通过控制培养基组成和培养条件，形成规则小球状菌体即为液体种子；

(4)牛樟芝液体发酵培养：将步骤(3)中的液体种子接入液体发酵培养基中，150-180rpm，25-28℃，发酵培养第8-10d时，加入吐温80；发酵培养第14-17d时，加入油酸；继续发酵至20d；