[发明专利]一种羊快疫单价灭活疫苗的制备方法

说明书

本发明涉及兽医微生物学技术领域，具体涉及一种羊快疫单价灭活疫苗的制备方法。该快疫单价灭活疫苗的制备方法包括：菌株的筛选、菌株的培养、菌株毒力验证及疫苗制备。本发明的腐败梭菌为分离自青藏高原牧区的高产毒鹿源腐败梭菌(QH‑FB01菌株)，常规培养对小白鼠的致死能力可达200MLD/ml，通过优化菌株最佳产毒条件、改进培养基配方，可使该腐败梭菌菌株(QH‑FB01菌株)对小白鼠的致死能力平均达1000MLD/ml，远高于常规疫苗生产用菌株的毒力100MLD/mL，且通过培养条件优化，使该腐败梭菌菌株的培养特性较为稳定，大大降低了生产成本，提高了生产效率。

技术领域

本发明涉及兽医微生物学技术领域，具体涉及一种羊快疫单价灭活疫苗的制备方法。

背景技术

腐败梭菌为土壤常在菌，气温多变、多雨潮湿季节及转群造成犊牦牛体质下降时，其可引起发病。由于本病发病急、死亡快、因此对于本病的防制主要用疫苗进行免疫预防。适时接种疫苗，尤其在牦牛转群或进入换季草场前进行加强免疫是预防本病的有效方法。

腐败梭菌培养物离心上清液皮下和静脉注射小白鼠时毒力较弱，表明其代谢产物中的抗原成分较少，故只有采用菌液制备灭活菌苗进行免疫才能保证免疫效果。目前用羊快疫疫苗常规疫苗生产用菌株的种子培养物的最小致死量要求在100MLD/ml，由于其毒力较低，制成的灭活疫苗存在免疫效果一般，免疫期较短的弊端。当菌株的毒力较低时，将会出现如下几个问题：(1)疫苗生产效率低下，企业生成成本提高；(2)疫苗中抗原含量降低，免疫保护力不足；(3)疫苗的免疫期缩短，需增加免疫次数，提高劳务成本；(4)抗原量过低或勉强能达到保护水平，存在潜在的免疫失败风险；(5)标准菌株与地方流行性菌株存在交叉免疫效果不良的现象，造成免疫失败。

因此，筛选具有优良产毒特性的地方高产毒菌株，对于提高羊快疫疫苗的免疫保护效果十分有必要；另外，通过优化培养方法，提高菌株的稳定性及产毒效率，对于提高企业生产效率，降低成本输出具有重要的意义。

发明内容

基于上述陈述，本发明的目的在于提供一种羊快疫单价灭活疫苗的制备方法。

一种羊快疫单价灭活疫苗的制备方法，包括如下步骤：

步骤1菌株的筛选：

S1：菌株厌气培养，将分离保存的菌株分别接种到肉肝胃酶消化汤培养基中，37℃培养12h，抹片镜检呈单一的梭状杆菌，革兰氏染色阳性；24h后，可见呈柠檬状芽孢产生，动物回归试验，在死亡小白鼠肝被膜触片可看见长丝状菌体；

S2：DNA检测，利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取S1步骤菌株的DNA，利用设计的16S rRNA通用引物进行PCR扩增，扩增产物经1.5％琼脂糖电泳检测可在1450bp处检测到目的条带，将扩增产物测序分析，与GENBANK中公布的腐败梭菌的同源性在99％以上，证明菌株血清型符合腐败梭菌属的特性；

步骤2菌株的培养：

将步骤1检测后的菌株接种到基础培养基中，37℃厌气培养，培养时间为12～72h，pH为7.5～8.8，收集培养液备用；

步骤3菌株毒力验证：将步骤2的培养菌物做递倍稀释，稀释比例为1:10，1:100，1:200，1:400，1:600，1:800及1:1000，皮下注射16～20g小白鼠，观察小白鼠死亡情况；

步骤4疫苗制备：

S1：杀菌、脱毒，将步骤2的收集的培养液按总体积的0.8％加入甲醛溶液，充分摇匀后，排出气体，38℃下杀菌3～5d，脱毒14～21d后，吸取培养物0.5～1.0ml接种至肉肝胃酶消化汤、普通斜面及营养肉汤中，37℃观察5～7d，无菌生长为合格，将脱毒后的培养物0.5ml原液皮下注射16～20g小白鼠5只，无小白鼠死亡为合格；