[发明专利]一种鉴别曼迪亚红豆杉雌雄幼苗的特异性分子标记及其应用方法

说明书

本发明公开了一种鉴别曼迪亚红豆杉雌雄幼苗的特异性分子标记及其应用方法。本发明的特异性分子标记为MDYX01F/MDYX01R。以特异性标记引物MDYX01F/MDYX01R作为扩增引物，通过常规PCR扩增反应和琼脂糖凝胶电泳检测，可以高效、准确的鉴别曼迪亚红豆杉雌雄幼苗。MDYX01F/MDYX01R为曼迪亚红豆杉雄性幼苗的特异性扩增引物，若待测样品为雄性单株，则会扩增出610bp大小的特异性DNA电泳条带；若待测样品为雌性单株，则为阴性反应。本发明方法操作简单，用时短，且结果准确，是鉴别早期曼迪亚红豆杉雌雄幼苗的高效分子辅助手段。

技术领域

本发明属于植物分子鉴定领域，具体涉及一种鉴别曼迪亚红豆杉雌雄幼苗的特异性分子标记及应用方法

背景技术

曼地亚红豆杉(Taxus madia)隶属红豆杉科(Taxaceae)红豆杉属(Taxus Linn)，为第四纪冰川时期孑遗植物，是珍稀濒危的常绿药用植物。曼迪亚红豆杉具有很高的药用价值，其富含紫杉烷二萜类化合物，其中紫杉醇是一种疗效良好的抗癌新药，它对卵巢癌、乳腺癌、肺癌及胃肠癌等有显著功效。曼迪亚红豆杉紫杉醇含量高达0.03～0.04％，这要远高于国内其他红豆杉树种(0.01～0.02％)，因此，曼迪亚红豆杉是提取紫杉醇非常好的原料。除此之外，曼迪亚红豆杉还具有非常高的观赏价值，常被用于园林景观设计、城市环境美化。

曼地亚红豆杉是雌雄异株植物，因此，在植树造林时合理培育和布局曼迪亚红豆杉雌雄幼苗，对曼迪亚红豆杉树种的保护，以及对其经济价值的提高都具有非常重要的意义。然而，目前对于雌雄红豆杉的鉴别还缺少十分有效的手段，尤其是在幼苗早期。本发明人之前的一个发明专利(CN104480210A)公开了一种鉴别曼地亚红豆杉幼苗的核苷酸序列、分子探针和方法。CN109486980A公开了一种用于鉴定曼地亚红豆杉的SNP分子标记，建立起了快速鉴定曼地亚红豆杉的体系。这两个发明专利虽然分别提供了曼迪亚红豆杉的一种鉴别方法，但是这两种方法只能区分曼迪亚红豆杉与其他红豆杉树种，而无法鉴别不同雌雄曼迪亚红豆杉之间的不同。杨马进等通过枝条和叶片形态特征对引种驯化20年的曼地亚红豆杉雌雄性别进行了鉴别(杨马进等，曼地亚红豆杉雌雄株枝条与叶片形态特性研究，四川林业科技，2016，37：37～40)。然而，茎、叶形态特征易受生境、气候、生理状况等的影响而常常导致主观辨别上的偏差，更何况早期曼迪亚红豆杉幼苗在形态特征差别非常小，因此，仅靠形态差异特征难以准确鉴别曼迪亚红豆杉雌雄植株。本发明从分子生物学层面入手，对曼迪亚红豆杉雌雄植株进行研究，成功开发出了可用于曼迪亚红豆杉幼苗性别鉴别的分子特异性标记引物。对曼迪亚红豆杉的种质鉴定、资源保护及品种选育等具有重要的意义。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种用于鉴别曼迪亚红豆杉雌雄幼苗的特异性分子标记，利用该分子特异性标记引物对能够有效的对曼迪亚红豆杉植株进行早期性别鉴定。

本发明的第一个目的提供一种用于鉴别早期曼迪亚红豆杉雌雄的特异性分子标记引物，其特征在于该引物的核苷酸序列如下：

上游引物MDYX01F:5’-TCGCGCCTTTGGACGGGTGCAC-3’，如SEQ ID NO.1所示；

下游引物MDYX01R:5’-GCACAAATCCGTGACCCCATG-3’，如SEQ ID NO.2所示；

为得到鉴别曼迪亚红豆杉雌、雄个体的特异性分子标记引物，前期我们应用了多种分子标记技术手段，并且进行了大量的PCR扩增及电泳筛选实验。最后发现，经过对曼迪亚雄、雌红豆杉样品基因组总DNA进行ITS-PCR扩增，然后，通过测序获得曼迪亚雄、雌红豆杉个体的ITS序列，最后，通过个体间ITS序列的碱基差异比对，发现曼迪亚红豆杉雌、雄个体间的ITS序列存在碱基差异，并且在此基础上，设计获得了特异性标记引物(MDYX01F/MDYX01R)。上述引物对具有极高的专一性，用此对引物对曼迪亚雌、雄单株进行PCR扩增，只有从雄株个体中获得610bp大小的特异性DNA片段，而雌株个体中无条带出现。其雄株扩增获得的特异性片段核苷酸序列SEQ ID NO.3所示：