[发明专利]一种检测单碱基突变的方法及应用

权利要求书

1.一种检测单碱基突变的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、DNA的提取：提取少量的动物或植物组织，放入杀菌消毒后的试管中，向试管中加入裂解溶液，将试管放置在高速离心机上离心，时间控制在5-10分钟；

S2、DNA的分离；

S3、DNA的纯化：在S2完成后，向试管内加入60％-70％的乙醇溶液以及浓度为10％-20％的TE溶液，并将试管放置在高速离心机内，高速离心3-5分钟，取试管内的下层溶液；

S4、DNA的分析；

S5、NDA的扩增：在DNA的试液中加入CRS引物，经过PCR扩增之后，其中“GCCG”为Hhal的酶切识别位点，从而使用CRS-PCR引物扩增等位基因时，在PCR的产物中就能够就形成了可由Hhal识别的酶切位点，酶切后每个等位基因的片段长度均不相等；

S6、DNA的检测：具体包括如下步骤：

M1、双链DNA分子采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，其由于迁移行为决定于其分子大小和电荷，不同长度的DNA片段能够在聚丙烯酰胺凝胶基础上被区分开；

M2、加入了尿素和甲酰胺的混合溶液组成的变性剂梯度，从而能够把同样长度但序列不同的DNA片段区分开来一个特定的DNA片段有其特有的序列组成，其序列组成决定了其解链区域和解链行为一个几百个碱基对的DNA片段一般有几个解链区域，每个解链区域有一段连续的碱基对组成；

M3、当变性剂浓度逐渐增加达到其最低的解链区域浓度，该区域这一段连续的碱基对发生解链，浓度再升高依次达到各其他解链区域浓度时，这些区域也依次发生解链，直到变性剂浓度达到最高的解链区域浓度后，最高的解链区域也发生解链，从而双链DNA完全解链从而双链DNA完全解链；

M4、不同DNA片段的序列差异发生在最高的解链区域时，这些片段就不能被区分开来，从而双链DNA完全解链，如果不同DNA片段的序列差异发生在最高的解链区域时，这些片段就不能被区分开来，DNA片段中每个碱基处的序列差异都能被区分开；

2.根据权利要求1所述的一种检测单碱基突变的方法，其特征在于，所述DNA的分析具体包括如下步骤：

1)、取DNA原液15μl稀释至3.0ml，用UV-1601型紫外分光光度计测定230nm、260nm以及280nm的吸光值，高质量的DNA的要求：A₂₆₀/A₂₃₀小于2.0；同时A₂₆₀/A₂₈₀介于1.7到1.9之间；

2)、将DNA原适液适当稀释后，用1XTAE，0.8％琼脂糖凝胶2V/cm电泳1小时进行质量监测；

3)、向一定量的原适液的DNA中加入限制性内切酶EcoR1至4-5U/μg的DNA，在温度37摄氏度的状态下保存24小时，用0.5 XTBE，0.8％琼脂糖凝胶2.5V/cm电泳3小时进行检测。

3.根据权利要求1所述的一种检测单碱基突变的方法，其特征在于，所述S1中DNA提取时加入的裂解溶液具体为0.1mol/L氯化钠溶液、10mol/L的Tris-HCI溶液以及1％SDS溶液。

4.根据权利要求1所述的一种检测单碱基突变的方法，其特征在于，所述S1中DNA提取时加入的裂解溶液的PH为8.0。

5.根据权利要求1所述的一种检测单碱基突变的方法，其特征在于，所述S2中的DNA的分离具体包括向在完成操作S1后，向试管内加入苯酚-氯仿溶液、氯仿-异戊醇溶液、冰无水乙醇以及5mol/L的氯化钠溶液，并将试管再次放置在高速离心机上进行离心，当试管内的溶液出现白色絮状沉淀时，停止离心。

6.一种根据权利要求1-5所述的一种检测单碱基突变的方法的用途，其特征在于，具体的用途如下：

F1、了解自身是否有家族性疾病的致病基因，预测患病风险：资料证实10％～15％的癌症与遗传有关，糖尿病、心脑血管疾病等多种疾病都与遗传因素有关；

F2、用于疾病的诊断：采用基因诊断的方法，不仅敏感性大大提高，而且在短时间内就能得到结果；

F3、正确选择药物，避免滥用药物和药物不良反应：根据基因检测的结果，可制定特定的治疗方案，从而科学地指导使用药物，避免药物毒副反应。