[发明专利]检测GSTP1基因相对表达量的双通道实时荧光定量RT-PCR方法

权利要求书

1.一种用于实时荧光RT-PCR反应的引物探针组合，其特征在于：包括特异性扩增GSTP1基因及β-actin基因部分片段的引物及TaqMan探针：

GSTP1上游引物GSF：5'-GTACCAGTCCAATACCATCCT-3'；

GSTP1下游引物GSR：5'-CCTGCTGGTCCTTCC-3'；

GSTP1探针GSP：5'-FAM-CGTCACCTGGGCCGCACCC-BHQ1-3'；

β-actin上游引物AF：5'-CAGCAGATGTGGATCAGCAAG-3'；

β-actin下游引物AR：5'-GCATTTGCGGTGGACGAT-3'；

β-actin探针AP：5'-HEX-AGGAGTATGACGAGTCCGGCCCC-BHQ1-3'。

2.根据权利要求1所述一种用于实时荧光RT-PCR反应的引物探针组合，其特征在于：所述GSTP1探针GSP中FAM为6-carboxyfluorescein。

3.一种检测GSTP1基因相对表达量的双通道实时荧光RT-PCR方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)以GSTP1基因为检测的目标基因，针对GSTP1基因部分片段设计特异性扩增引物和TaqMan探针：

GSTP1上游引物GSF：5'-GTACCAGTCCAATACCATCCT-3'；

GSTP1下游引物GSR：5'-CCTGCTGGTCCTTCC-3'；

GSTP1探针GSP：5'-FAM-CGTCACCTGGGCCGCACCC-BHQ1-3'；

2)以β-actin基因为检测的内参基因，针对β-actin基因部分片段设计特异性扩增引物和TaqMan探针：

β-actin上游引物AF：5'-CAGCAGATGTGGATCAGCAAG-3'；

β-actin下游引物AR：5'-GCATTTGCGGTGGACGAT-3'；

β-actin探针AP：5'-HEX-AGGAGTATGACGAGTCCGGCCCC-BHQ1-3'；

3)从待测样本中提取总RNA，得到待测样本总RNA；

4)将RT-PCR缓冲液、反转录酶、Taq酶、待测样本总RNA、针对GSTP1基因的扩增引物和TaqMan探针以及针对β-actin基因的扩增引物和TaqMan探针按比例混合，得反应体系；

5)将反应体系按照反应程序进行反转录及实时荧光定量PCR反应，其中，分别利用FAM通道和HEX通道进行双通道荧光采集；

6)根据实时荧光定量PCR的定量结果，采用双标准曲线法计算待测样本中GSTP1基因的相对表达量。

4.根据权利要求3所述一种检测GSTP1基因相对表达量的双通道实时荧光RT-PCR方法，其特征在于：所述反应体系中，GSTP1上游引物GSF的浓度为150-250nM，GSTP1下游引物GSR的浓度为150-250nM，GSTP1探针GSP的浓度为100-150nM，β-actin上游引物AF的浓度为150-200nM，β-actin下游引物AR的浓度为150-200nM，β-actin探针AP的浓度为100-150nM，待测样本总RNA的含量≥10ng。

5.根据权利要求3所述一种检测GSTP1基因相对表达量的双通道实时荧光RT-PCR方法，其特征在于：所述反应程序为：42℃反转录5min；95℃预变性10s；95℃变性5s，58℃退火34s，进行35-40个扩增循环，并从第一个循环开始采集荧光信号。

6.根据权利要求3所述一种检测GSTP1基因相对表达量的双通道实时荧光RT-PCR方法，其特征在于：根据实时荧光定量PCR的定量结果，若β-actin基因对应的Ct值在17-21范围内，且GSTP1基因对应的Ct值≤30，则判定GSTP1基因在待测样本中表达。