[发明专利]甲型流感病毒H8N7的检测试剂盒及检测方法

说明书

本发明公开了一种甲型流感病毒H8N7的检测试剂盒，所述试剂盒包括病毒核酸快速提取试剂、PCR扩增试剂、PCR酶混合液、H8N7检测试剂、阳性对照品、阴性对照品；所述H8N7检测试剂包含H8N7扩增引物和探针。本发明采用的病毒核酸快速提取试剂配方可用于病毒RNA快速提取，只需要常温静置5‑10min，大大缩短了提取时间、提高了提取效率，且对后续PCR扩增体系具有促进作用，提高PCR检测效率；且本发明针对甲型流感病毒H8N7亚型的特异性扩增引物探针，该引物探针序列为首创且设计独特，特异性好，灵敏度高，能够实现高效、精准的分型检测甲型流感病毒H8N7亚型。本发明还提供了甲型流感病毒H8N7的检测方法。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种RT-PCR扩增技术，具体涉及一种甲型流感病毒H8N7的检测方法及检测试剂盒。

背景技术

流感病毒分为甲、乙、丙三型，甲型流感病毒为最常见且最容易发生变异的流感病毒，流感大流行就是甲型流感病毒出现新亚型或旧亚型重现引起的。甲型流感病毒具有两种特异性的囊膜蛋白，即血凝素(Hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)，根据HA和NA蛋白抗原性不同，主要分为16个H亚型(H1-H16)和9个N亚型(N1-N9)。

近年来的研究发现，HA和NA基因之间存在某种平衡对病毒的致病性有很大关系。甲型流感病毒H8N7亚型是异于普通甲型流感的一种新变种甲型流感病毒，拥有飞沫传播和水源传播的特性，且容易进化为空气传播型，此种病毒的致死率预计达到100％，对人类造成极大的生命威胁。由此可见，针对甲型流感病毒H8N7的快速准确地检测对于流感病毒的及时诊断及防御至关重要。

荧光定量PCR技术是一种传统的生物分子检测方法，具有高敏感、高特异、高准确性且能实现多重实时检测的优势，目前已被广泛用于核酸(DNA/RNA)分子检测。目前，在荧光定量PCR技术平台针对甲型流感病毒H8N7的检测方法未见报道，因此，本领域技术人员极有必要利用该平台开发一种高敏感、高特异、高准确性的一步法实时荧光定量RT-PCR检测方法及试剂盒，实现对甲型流感病毒H8N7亚型的检测。

发明内容

针对上述现有技术中的不足，本发明要解决的技术问题是提供一种甲型流感病毒H8N7的检测试剂盒及检测方法。

为实现上述目的提供一种甲型流感病毒H8N7的检测试剂盒，本发明采用了以下技术方案：

一种甲型流感病毒H8N7的检测试剂盒，所述试剂盒包括病毒核酸快速提取试剂、PCR扩增试剂、PCR酶混合液、H8N7检测试剂、阳性对照品、阴性对照品。

优选的，所述病毒核酸快速提取试剂包含：pH为10.0的500mM Tris-HCl、10％v/vTritonX100、4M异硫氰酸胍、100mM KCl、pH为8.0的0.2M EDTA。

优选的，所述PCR扩增试剂包含：2×PCR buffer、50mM MgCl₂、pH为10.0的100mMTris-HCl、0.5mM dNTP、5％g/ml BSA。

优选的，所述所述阳性对照品为：HA8基因和NA7基因的两个合成基因片段连接到一个pUC57质粒载体上，然后以DEPC水进行10⁶倍稀释，作为最终的阳性对照。

优选的，所述PCR酶混合液包括0.5U/μl逆转录酶、5U/μl DNA聚合酶、5×RNA酶抑制剂。

优选的，所述H8N7检测试剂包含：H8N7基因的扩增引物和探针；探针H8N7-P1的5’端标记有报告荧光染料FAM，3’端标记有淬灭荧光染料BHQ；探针H8N7-P2的5’端标记有报告荧光染料VIC，3’端标记有淬灭荧光染料BHQ；引物探针序列为：

H8N7-F1：5’-GCTGGATGCTGACGGAACTTAG-3’