[发明专利]一种串联凝胶色谱法测定金钗石斛多糖分子量分布的方法

说明书

本发明公开了一种串联凝胶色谱法测定金钗石斛多糖分子量分布的方法，以串联的Ultrahydrogel 500柱和Ultrahydrogel 120柱为色谱柱，以含0.01~0.05wt%叠氮化钠的0.01~0.1mol/L的磷酸钠缓冲溶液为流动相。本发明通过色谱柱及流动相的选择，能够便捷、快速的实现不同分子量的金钗石斛多糖的分离，提高了金钗石斛多糖分子量分布的准确度。经验证，本发明方法与采用单一色谱柱或其他类型的色谱柱串联的方法相比，峰形好、结果重现性高、分离度好、准确度高、分子量检测范围宽，具有普遍适用性。

技术领域

本发明涉及一种测定金钗石斛多糖分子量分布的方法，具体涉及一种串联凝胶色谱法测定金钗石斛多糖分子量分布的方法。

背景技术

金钗石斛是我国传统名贵中药，为兰科石斛属植物，又名扁金钗、金钗石、扁黄草等，为传统中药石斛的来源之一，为中国药典所收载。金钗石斛的主要有效成分为石斛碱和多糖，具有滋阴清热、免疫调节、抗氧化、抗肿瘤、降血糖降血脂等功效。金钗石斛多糖以其独特的作用在临床上具有广泛的应用前景。

然而，在开发金钗石斛多糖的研究过程中，金钗石斛多糖的分子量及分子量分布没有标准的检测方法，使得金钗石斛多糖药物没有统一的标准，对该药物的应用和推广造成了极大地阻碍，因此，非常有必要建立一套准确、稳定的金钗石斛多糖分子量及分子量分布检测方法。

发明内容

多糖实际上是一种化学结构相似而聚合程度不同的分子混合物，其分子量范围跨越几个数量级，凝胶色谱法是迄今为止应用最为广泛的多糖分子量研究方法之一。针对目前没有金钗石斛多糖分子量及分子量分布测定方法的不足，本发明提供了一种串联凝胶色谱法测定金钗石斛多糖分子量分布的方法，该方法实现了金钗石斛多糖大分子的高效分离，同时有效的扩大了分子量测定范围，提高了金钗石斛多糖分子量分布检测的准确度和便捷性。

凝胶色谱法的分离机理是利用体积排除原理，多糖在凝胶柱上被洗脱的过程中，不同分子量大小的多糖与保留时间有一定的关系，本发明先用一系列已知分子量的葡聚糖为标准品，将标准品与保留时间校正得到标准曲线，再通过样品的保留时间计算相对分子量。由于金钗石斛多糖的化学结构复杂，在凝胶色谱柱的选择中，本发明将两个特定的色谱柱串联起来，扩大了金钗石斛多糖可检测的分子量范围，以覆盖更为复杂的样品分析，且色谱柱串联也提高了不同分子量的金钗石斛多糖的分离，提高了检测效果。

本发明具体技术方案如下：

一种串联凝胶色谱法测定金钗石斛多糖分子量分布的方法，采用凝胶色谱法测定金钗石斛多糖的分子量，色谱条件如下：

色谱柱：串联的Ultrahydrogel 500柱和Ultrahydrogel 120柱；

检测器：示差折光检测器；

流动相：含0.01~0.05wt%叠氮化钠的0.01~0.1mol/L的磷酸钠缓冲溶液；

流速：0.6~1mL/min；

柱温：40~60℃；

检测器温度：30~45℃；

进样量：5~10μL。

进一步的，所述Ultrahydrogel 500柱和Ultrahydrogel 120柱串联连接在一起，样品和流动相先流入Ultrahydrogel 500柱，再流入Ultrahydrogel 120柱，Ultrahydrogel500柱先将大分子量组分分离，小分子组分则在Ultrahydrogel 120柱中分开。其中，色谱柱规格为：300mm×7.8mm，色谱柱填料均为羟基化的聚甲基丙烯酸甲酯。

进一步的，流动相的pH为6.5~7.5，优选为7。