[发明专利]一种酶法降解2;6-二羟基苯甲酸的方法

权利要求书

1.一种酶法降解2,6-二羟基苯甲酸的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：

步骤一：Sdc蛋白表达：将表达质粒转化到宿主菌中，构建突变Sdc基因表达菌株，将菌株接种于Amp浓度为90～110μg·mL-1的LB液体培养基中，摇床培养为一号种子液；将一号种子液按0.8～1.5％的比例接种于新的Amp浓度为90～110μg·mL-1的LB液体培养基中，摇床培养为二号种子液，并使其OD600到达0.4～0.8，然后加入IPTG使其成为最终浓度为0.08～0.2mM的培养液，培养液经诱导、离心后，收集菌体备用；

步骤二：Sdc的纯化：将步骤一中收集的菌体用超声破碎缓冲液重悬，在冰浴中进行超声破碎，将破碎后的细胞破碎液进行离心分离，上清液即为粗酶液；将粗酶液用10～14％的SDS-PAGE检测蛋白表达情况，采用His-Trap亲和层析柱对Sdc进行纯化；

步骤三：Sdc浓度测定：使用Bradford蛋白浓度测定试剂盒测定纯化酶Sdc的浓度；

步骤四：Sdc活力测定：在浓度为10～60mM的2,6-二羟基苯甲酸溶液中加入含0.1mg/mLSdc的缓冲溶液，总反应体积为1～2mL，温度25～60℃，加入强酸性溶液终止反应，反应液经9500～10500r/min离心后，经0.22μm滤膜过滤后，用HPLC测定产物浓度。

2.根据权利要求1所述的酶法降解2,6-二羟基苯甲酸的方法，其特征在于：所述His-Trap亲和层析柱对Sdc纯化的步骤为：

I、启动系统：首先打开蛋白纯化系统电源，待系统稳定后，启动工作站，打开A泵和B泵，用MilliQ水以5mL·min-1的速度冲洗系统管路至基线水平；

II、接柱子：将镍柱His-Trap FF crude与纯化系统的管路连接，注意不要带入气泡，然后用大于等于5个柱体积的MilliQ水以1mL·min-1的速度对柱子进行冲洗；

III、柱平衡：将A泵头放入结合缓冲液中，B泵头放入洗脱缓冲液中，先用大于等于5个柱体积的洗脱缓冲液以1mL·min-1速度冲洗柱子，然后再用大于等于5个柱体积的结合缓冲液在同样的流速下对镍柱进行平衡；

IV、上样：用A泵将5mL粗酶液上到柱上；

V、平衡：用15个柱体积的结合缓冲液以0.5mL·min-1的速度冲洗，直到吸收曲线稳定，此时目的蛋白结合在镍柱上，而杂蛋白则被冲洗下来；

VI、洗脱：用5个柱体积的洗脱缓冲液以1mL·min-1的速度进行洗脱，根据吸收曲线来收集目的蛋白；

VII、柱再生：以1mL·min-1的速度用洗脱缓冲液对柱子进行充分的冲洗，然后在同样的流速下用MilliQ水冲洗到基线稳定，最后在其中充满20％乙醇，拆卸后将柱子封好置于4℃保存；

VIII、关闭系统：蛋白纯化系统的全部管路用MilliQ水冲洗干净后充满20％的乙醇，先关闭工作站程序，然后关闭所有设备的电源。

3.根据权利要求2所述的酶法降解2,6-二羟基苯甲酸的方法，其特征在于：所述步骤四中HPLC检测产物间苯二酚的条件为：色谱柱为C18柱，以体积比2：8的甲醇-体积浓度0.1％甲酸溶液为流动相，柱温35℃，流动相流速1mL/min，检测波长278nm。

4.根据权利要求3所述的酶法降解2,6-二羟基苯甲酸的方法，其特征在于：所述步骤一中一号种子液的培养条件为：温度为35～40℃，转速为150～170rpm的条件下摇床培养11～13h；二号种子液的培养条件为：温度为35～40℃下，转速为150～170rpm的条件下摇床培养3～5h；步骤一中培养液的诱导条件为：温度为22～28℃、转速为110～130rpm的条件下诱导17～19h；培养液的离心条件为：温度为3～5℃、转速为4800～5200rpm的条件下离心8～12min。

5.根据权利要求4所述的酶法降解2,6-二羟基苯甲酸的方法，其特征在于：所述步骤二中的超声条件为：功率20～60％，工作2～5s，间歇5～8s，总超声时间为9～11min；离心分离条件为：在3～5℃、13000～15000rpm的条件下离心13～17min。