[发明专利]一种羧酸酯酶-pH连续双比率双光子线粒体锁定荧光探针及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种羧酸酯酶-pH连续双比率双光子线粒体锁定荧光探针，其特征在于，荧光探针结构式如式CEMT所示：

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2.一种权利要求1所述的羧酸酯酶-pH连续双比率双光子线粒体锁定荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将4-甲基吡啶和1,4-双（氯甲基）苯在甲苯中溶解，搅拌，加热回流，得产物5;

(2)将产物5和产物4在乙醇中溶解，加入无水哌啶反应得产物HMT；

(3)将产物5、HMT和NaOAc混合溶于Ac₂O，反应得羧酸酯酶-pH连续双比率双光子线粒体锁定荧光探针CEMT；

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3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述的产物5的制备方法为将50mmol 4-甲基吡啶和55 mmol 1,4-双（氯甲基）苯在甲苯中溶解，室温下搅拌4小时，加热回流30分钟后冷却、过滤，用无水乙醚洗涤得产物5。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述的产物HMT的制备方法为将1mmol产物5和0.5mmol产物4加入到50mL乙醇中溶解，加入0.05mL无水哌啶，加热回流12小时，缓慢冷却至室温，再冷却到-20℃，过滤，用乙醇洗涤，使用体积比为1:2的CH₃OH:CH₂Cl₂混合溶剂进行色谱纯化。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）所述的CEMT的制备方法为将1mmol产物5、0.6mmol HMT和2.04mmol NaOAC混合溶于6mLAc₂O中，在Ar气氛中、80℃条件下搅拌7小时，减压浓缩得粗品，粗品溶于DCM中提纯得CEMT。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的产物4的制备方法为：

a) 将2 ,4-二羟基苯甲醛溶解于乙醇中，溶解浓度0.02～0.06g/mL，然后加入戊烯二酸二乙酯，溶解浓度0.067g/mL，混合均匀后滴加无水哌啶 2～5 mL，回流24 小时，冷却，过滤，固体用无水乙醇重结晶，得产物1；

b) 将产物 1 溶解于无水吡啶中，溶解浓度0.025g/mL，然后加入乙酸酐，加入浓度为1mol/L，搅拌0.5 小时，后于冰中继续搅拌10 分钟，析出灰白色固体，用水和NaCl饱和溶液洗涤，Na₂SO₄干燥并减压除去溶剂，使用体积比为1:5的CH₃CN:CH₂Cl₂混合溶剂色谱纯化，得到白色固体即为产物2；

c) 将产物 2 溶解于四氢呋喃中，溶解浓度0.011 g/mL，然后加入质量分数4%的四氧化锇水溶液 2 mL，搅拌0.5 小时，然后加入高碘酸钠，加入浓度为0.017g/mL，室温下搅拌5～6天，减压蒸馏除去THF，加入二氯甲烷和水溶液分层，有机层干燥，得到白色固体，固体用体积比为从1:0～5的二氯甲烷-乙腈体系洗脱剂梯度洗脱，旋蒸，得产物3；

d) 将产物3溶解于甲醇中，溶解浓度0.012 g/mL，然后加入无水碳酸钾，溶解浓度0.015 g/mL，室温下搅拌0.5 小时，TLC分析原料消耗完毕后，加入pH至3～4的盐酸进行酸化，析出固体，过滤，滤饼用水洗涤，真空干燥，得产物4；

具体合成路线图如下：

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7.一种权利要求1所述的羧酸酯酶-pH连续双比率双光子线粒体锁定荧光探针在原位检测羧酸酯酶介导的线粒体酸化的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的羧酸酯酶-pH连续双比率双光子线粒体锁定荧光探针应用于生命体或细胞中原位检测羧酸酯酶介导的线粒体酸化的应用。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的羧酸酯酶-pH连续双比率双光子线粒体锁定荧光探针连续地响应羧酸酯酶和pH的变化、并对线粒体进行锁定来实现原位实时检测。