[发明专利]一种miRNA在制备预防或诊断血脂异常肝郁证试剂中的应用

权利要求书

1.一种miRNA在制备预防或诊断血脂异常肝郁证试剂中的应用。

2.如权利要求1所述的一种miRNA在制备预防或诊断血脂异常肝郁证试剂中的应用，其特征在于，所述试剂为通过检测血清中miRNA的表达水平来诊断血脂异常肝郁证的产品。

3.如权利要求2所述的一种miRNA在制备预防或诊断血脂异常肝郁证试剂中的应用，其特征在于，所述试剂可基于定量PCR方法检测血脂异常肝郁证样本中miRNA的靶基因的表达情况。

4.如权利要求3所述的一种miRNA在制备预防或诊断血脂异常肝郁证试剂中的应用，其特征在于，所述miRNA的靶基因的表达情况为15个上调miRNA miR-382-5p、miR-432-5p、let-7f-5p、miR-454-3p、miR-374a-5p、miR-126-5p、let-7a-5p、miR-142-3p、miR-26a-5p、miR-27b-3p、miR-27a-3p、let-7d-5p、miR-652-3p、miR-148a-3p、miR-30e-5p，有9个下调miRNA miR-34c-5p、miR-181c-5p、miR-193b-3p、miR-129-2-3p、miR-149-5p、miR-542-5p、miR-133a、miR-133b、miR-124-3p。

5.如权利要求4所述的一种miRNA在制备预防或诊断血脂异常肝郁证试剂中的应用，其特征在于，所述定量PCR方法检测miRNA表达情况包括如下步骤：

步骤1，利用miRNA逆转录试剂盒(Exiqon，Danmark)将20-25ng的总RNA反转录成cDNA；

步骤2，在定量PCR仪上对cDNA进行实时定量PCR扩增,Real-time PCR循环条件：

PCR反应条件为：95℃预变性10min，然后95℃10s，60℃60s，进行40个循环；

步骤3，数据分析：

a.计算每个处理组中的每个通路相关基因的ΔCt：ΔCt(group 1)＝average Ct–average of HK genes’Ct for group 1 array；ΔCt(group 2)＝average Ct–average ofHK genes’Ct for group 2 array；

b.计算2个PCR Array(或两组)中每个基因的ΔΔCt：ΔΔCt＝ΔCt(组2)-ΔCt(组1)；

c.通过2^-ΔΔCt计算组2与组1对应基因的表达差异。

6.如权利要求5所述的一种miRNA在制备预防或诊断血脂异常肝郁证试剂中的应用，其特征在于，所述定量PCR方法检测miRNA表达谱包括如下步骤：

S1、准备Real-time PCR试剂

将制备的cDNA模板，nuclease free water和SYBR^TMGreen master mix置于冰上溶解15-20分钟，SYBR^TMGreen master mix应避光溶解，使用前应倒置混匀，其他试剂震荡混匀，所有试剂应离心后使用，所有试剂和反应液应始终与冰上操作；

S2、稀释cDNA模板

将RT反应获得的cDNA模板用nuclease free water稀释110倍；

S3、混合所有反应试剂，操作如下：

A.将PCR板简单离心后，移去封膜；

B.将110倍稀释的cDNA模板与2×SYBR Green master mix按照1：1混合(例如2200ul 2×master mix和2200ul稀释的cDNA模板混合)；

C.倒置混匀反应液并离心；

D.将混合反应液根据下表的建议加入板中的每个孔；

E.重新封好PCR板：