[发明专利]一种质粒载体及其构建方法与应用

说明书

本发明公开了一种质粒载体及其构建方法与应用，属于生物技术领域。本发明质粒载体为A3EGFP‑ATPaseβ gRNA质粒载体，包括gRNA scaffold元件BUg53TB、3×P3启动子和标记基因表达盒，其中gRNA scaffold元件BUg53TB的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，包含gRNA的核苷酸序列和片段BUg53TB元件均位于3×P3启动子前。本发明gRNA质粒载体A3EGFP‑ATPaseβ gRNA上携带有可视化的增强型绿色荧光蛋白，采用脂质体转染的方法，将此gRNA质粒载体A3EGFP‑ATPaseβ gRNA在High Five细胞中表达，可极其方便地观察gRNA质粒载体在细胞内的转染情况，也可以此来对其后代进行荧光追踪，降低鉴定时的工作量。

技术领域

本发明涉及一种质粒载体及其构建方法与应用，属于生物技术领域。

背景技术

CRISPR/Cas9基因定点编辑技术如今已成为基因功能与应用研究的重要手段，它可以实现在生物体内基因组特定位点人为地对遗传物质进行改造，且由此产生的基因编辑和功能改变可稳定地在后代间传递。利用CRISPR/Cas9进行基因编辑主要是通过gRNA(guide RNA)识别特定的基因序列，并引导Cas9蛋白在特定靶点处识别并对DNA双链进行切割，产生DNA双链断裂(DSB)，进而激活细胞内的DSB修复机制以达到定点改造的目的。

但是在CRISPR/Cas9具体的应用中仍存在许多问题，例如有些CRISPR/Cas9质粒不携带荧光标记基因或者携带的荧光标记标签太弱，不仅无法在转染进细胞后通过观察荧光确定转染效果，也会因此影响我们对CRISPR/Cas9质粒转入细胞后的基因敲除效果判断；同时，有些载体不仅酶切位点少，而且载体过大，致使很难转化，DNA产量也低。采用RNAi方法来降低基因表达量的方法也是实验室常用方法，但其产生的沉默效果只能短暂存在，无法在后代个体内稳定存在并遗传。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，提供了一种质粒载体及其构建方法与应用，本发明质粒载体具有增强型绿色荧光标记基因，将质粒载体转染细胞后，便于在细胞水平上观察转染效果。

一种质粒载体，质粒载体为A3EGFP-ATPaseβgRNA质粒载体，包括gRNA scaffold元件BUg53TB、3×P3启动子和标记基因表达盒，其中gRNA scaffold元件BUg53TB的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，包含gRNA的核苷酸序列和片段BUg53TB元件均位于3×P3启动子前。

所述标记基因表达盒包括选择基因表达盒和报告基因表达盒。

进一步地，所述选择基因表达盒包括在大肠杆菌中使用的选择基因表达盒，选择基因表达盒为氨苄青霉素抗性基因表达盒，报告基因表达盒为绿色荧光蛋白表达盒；优选的，绿色荧光蛋白表达盒为增强型绿色荧光蛋白表达盒；

所述gRNA scaffold元件BUg53TB的第一酶切位点位于gRNA scaffold片段BUg53TB 5’端，gRNA scaffold元件BUg53TB的第二酶切位点位于gRNA scaffold片段BUg53TB 3’端，第一酶切位点和第二酶切位点均为BglⅡ，第一酶切位点或第二酶切位点来源于改造的片段BUg53TB；

所述质粒载体，还包括启动gRNA表达的U6启动子，U6启动子的核苷酸序列如SEQID No.3所示。

进一步地，所述U6启动子为家蚕的U6启动子；

所述U6启动子为RNA聚合酶III依赖的启动子；

所述质粒载体的构建方法，具体步骤如下：