[发明专利]一种用于猪赛内卡病毒巢式RT-PCR检测的引物组、试剂盒及应用

权利要求书

1.一种用于猪赛内卡病毒巢式RT-PCR检测的引物组，所述引物组包括外侧上游引物、外侧下游引物、内侧上游引物和内侧下游引物；所述外侧上游引物、外侧下游引物、内侧上游引物和内侧下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：4所示。

2.一种用于猪赛内卡病毒巢式RT-PCR检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述引物组。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括RT Buffer、RNA酶抑制因子、反转录酶、MgCl₂、PCR Buffer、dNTPs和Taq DNA聚合酶。

4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品包括猪赛内卡病毒；所述阴性对照品包括DEPC水。

6.权利要求1所述的引物组或权利要求2～5任意一项所述的试剂盒在非诊断目的的猪赛内卡病毒巢式RT-PCR检测中的应用，其特征在于，所述应用包括以下步骤：

1)提取待测样品总RNA，以待测样品总RNA为模板，进行反转录反应，得到待测样品cDNA；

2)以待测样品cDNA为模板，利用权利要求1所述外侧上游引物和外侧下游引物进行第一轮RT-PCR扩增反应，得到第一轮RT-PCR扩增产物；

3)以第一轮RT-PCR扩增产物为模板，利用权利要求1所述内侧上游引物和内侧下游引物进行第二轮RT-PCR扩增反应，得到第二轮RT-PCR扩增产物；

4)用琼脂糖凝胶电泳对第二轮RT-PCR扩增产物进行检测，在523bp处出现扩增条带表示待测样品中含有猪赛内卡病毒；在523bp处未出现扩增条带表示待测样品中不含有猪赛内卡病毒。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤2)中所述第一轮RT-PCR扩增反应使用的反应体系以25μL计包括：待测样品cDNA 4μL，浓度为2.5U/μL Taq DNA聚合酶0.5μL、浓度为10mmol/L dNTPs 0.5μL、10×PCR Buffer2.5μL、浓度为25mmol/L MgCl₂ 2μL、浓度为10μmol/L外侧上游引物2μL、浓度为10μmol/L外侧下游引物2μL和DEPC水11.5μL。

8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于，步骤2)中所述第一轮RT-PCR扩增反应的程序为：95℃5min，94℃1min、55℃1min、72℃1min 30个循环，72℃7min，反应结束。

9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤3)中所述第二轮RT-PCR扩增反应使用的反应体系以25μL计包括：第一轮RT-PCR扩增产物0.2μL，浓度为2.5U/μL Taq DNA聚合酶0.5μL、浓度为10mmol/L dNTPs 0.5μL、10×PCR Buffer 2.5μL、浓度为25mmol/L MgCl₂ 2μL、浓度为10μmol/L内侧上游引物1μL、浓度为10μmol/L内侧下游引物1μL和DEPC水17.3μL。

10.根据权利要求6或9所述的应用，其特征在于，步骤3)中所述第二轮RT-PCR扩增反应的程序为：95℃5min，94℃1min、52℃1min、72℃1min 30个循环，72℃7min，反应结束。