[发明专利]一种FMR1基因CGG重复序列的检测方法及其应用

说明书

本发明涉及分子生物学诊断领域，具体涉及一种FMR1基因CGG重复序列的检测方法及其应用。FMR1基因PCR扩增反应检测方法包含至少四种引物，至少一种以上增强剂，对FMR1基因5’端非转录区中CGG重复序列进行扩增。同时此FMR1基因PCR扩增方法应用于脆性X综合症相关基因FMR1基因核酸检测试剂盒，通过PCR扩增、毛细管电泳分析PCR产物，该试剂盒能对高CGG重复序列进行精确定量分析，方法简单、快速、准确的检测方法，只需要一次PCR实验即可检测出CGG重复数的变异情况，从DNA样本开始，6小时内可以出结果，检测技术流程简单，容易实现标准化。

技术领域

本发明涉及分子生物学诊断领域，具体涉及一种FMR1基因PCR扩增方法与脆性X综合症相关基因FMR1基因核酸检测试剂盒及其应用。

背景技术

脆性X综合症是仅次于唐氏症，造成智能障碍的第二原因，然而大部分的唐氏症不会遗传，但脆性X综合症是一种性联遗传性疾病。脆性X综合症具有范围广泛的病征，从轻微的学习障碍到严重智能障碍都有可能发生。除了智能障碍外，其他可能的现象包括:情绪问题、语言迟缓、注意力不集中、过动、自闭、不善与人接触等。根据统计，此症男性发生率约1/4,000，女性的发生率约 1/5,000-1/8,000。

致病的原因是FMR1基因内5’端非转录区发生CGG重复次数异常增加，导致FMRP基因产物的缺失或减少，FMRP是一种重要的脑部物质，为RNA结合蛋白，可调节许多突触蛋白的合成，缺乏时会会影响大脑发育和功能异常。美国医学遗传学会(ACMG)依据FMR1 CGG重复次数，定义出CGG重复次数小于45为“正常型”、CGG重复次数45-54为“中间型”、CGG重复次55-200为“前突变型”及CGG重复次数大于200为“全突变型”等，“正常型”和“中间型”不会有临床症状，“前突变型”称之为携带者，“全突变型”就会成为患者。当CGG重复中出现AGG能帮助预测对于CGG重复次数遗传至下一代时，CGG重复是否有扩展的风险。80% 脆性X综合症病人有家族病史，家族成员是此症的高风险族群，遗传机率高达二分之一。在脆性症的患者中，20%并没有家族史，是由为没有症状的“前突变型”的母亲所生下。当带因者的CGG重复次数越多，下一代的就有越高的风险生下患者。一旦超过200次就会发病，因此女性带因者最多会有50%的机会生下脆性症宝宝；男性带因者的FMR1基因变异会遗传给女儿，而不会传给儿子。带因父亲所生的女儿也是携带者，她的智力虽然正常，但她所生的小孩却有生下脆性症宝宝的风险。

目前脆性X综合症常见的分子检测方法为印迹杂交法（Southern Blot）、聚合酶链式反应扩增法（Polymerase Chain Reaction, PCR）。印迹杂交法能确定较大CGG重复序列的数目，并能评估FMR1基因的甲基化程度，但DNA需要量大，且对CGG重复较少的前突变型或者嵌合型样本，可能漏检或误诊，无法准确定值CGG重复数，同时因为操作繁琐，费时费力，对实验设备和人员培训要求较高，一般实验室难于实现。基于PCR扩增FMR1基因，毛细管电泳检测扩增片段比传统的琼脂糖凝胶电泳分辨率更高，但由于扩增片段CG比例太高，难度随着重复数次数的增加，通常大部分的PCR引物的设计，因为PCR反应体系未能调整至最佳条件，当遇到前突变型和全突变型，或者正常型和全突变型，这类嵌合型的样本，通常未能检测出全突变型的片段，可能导致检测结果误判。

较新的检测方法是重复引物 PCR 技术，又称为三引物 PCR 法 (Tripletrepeat-primed PCR, TP-PCR)。1996 年Warner等发明此种方法用以诊断 DM1 超大片段(CAG重复异常)动态突变患者。TP-PCR法有别于传统 PCR扩增，其反应中加入 3 个引物。FMR1基因的TP-PCR法在一般的PCR扩增基础下，新增了CGG序列引物，可以作为全突变型的辅助诊断，确认是否含有全突变的片段，解决了一般PCR在大片段扩增效率较差而误判的问题，但CGG的扩增效率太高，会抑制大片段的反应，同时定量的校准品跨度不够宽，对于较大重复数不能进行精确定量分析，可能还是有误判的风险。

发明内容