[发明专利]一种用于化脓链球菌检测的试剂盒

说明书

本发明提供一种用于化脓链球菌检测的试剂盒，包含一种特异性靶向化脓链球菌rpoB基因的向导RNA、扩增引物对、水化TwistAmp basic kit反应干燥球、LbCas12a蛋白、单链DNA探针(ssDNA)、Ribonuclease Inhibitor和缓冲液。使用该试剂盒进行化脓链球菌检测，检测的特异性高，可以将化脓链球菌与其他链球菌，包括停乳链球菌、无乳链球菌区分开来。同时，使用本发明所述RNA序列进行检测，耗时在1小时左右，不需要PCR仪，对设备要求低，显著低于传统的细菌培养法或PCR测序法，临床实用价值大。

技术领域

本发明属于致病菌检测领域，涉及一种用于化脓链球菌检测的试剂盒。利用此试剂盒可以进行化脓链球菌快速检测。

背景技术

化脓链球菌是人体感染的革兰阳性菌中常见菌群，给患者及社会带来巨大负担。传统的检测方法是进行细菌培养或PCR联合测序，但细菌培养需要5-7天的时间，而PCR常由于缺乏特异性引物，无法将化脓链球菌与其他链球菌区分，故而需要联合一代测序才能鉴定，成本高，需要数天时间才能出结果。在这期间临床医师由于没有获得检测结果，只能凭经验用药，常常导致疾病治疗的延误。因而，如何快速检测化脓链球菌显得尤为重要。近期，张峰等人发现，LbCas12a蛋白可用于致病菌的检测，只需要1小时左右即可完成检测，省时省力，灵敏度高。具体的原理为，该系统包含LbCas12a蛋白、致病菌DNA、向导RNA、两端分别带荧光基团和淬灭基团的单链DNA(ssDNA)。其中，致病菌DNA序列需要包含TTTN的PAM结构，同时该序列需要具备特异性，即区别于别的致病菌。而向导RNA序列为致病菌特异性靶向序列中TTTN后的一段序列，长度为20-24个碱基。在向导RNA引导下，LbCas12a蛋白可结合到致病菌特异性DNA序列上，随后，LbCas12a蛋白可表现出Dnase活性，从而切割两端分别带荧光基团和淬灭基团的单链DNA，使得荧光基团和淬灭基团分离，出现荧光，从而指示致病菌的存在。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于化脓链球菌检测的试剂盒，包含一种特异性靶向化脓链球菌rpoB基因的向导RNA、RPA扩增引物对、水化TwistAmp基础试剂盒(TwistAmpbasic kit)反应干燥球、LbCas12a蛋白、单链DNA探针(ssDNA)、RNA酶抑制剂(RibonucleaseInhibitor)和缓冲液。其中特异性靶向化脓链球菌rpoB基因的向导RNA，其核苷酸序列如SEQ No.1所示，能特异性靶向化脓链球菌，而不能靶向停乳链球菌、无乳链球菌，可用于化脓链球菌的检测。其中RPA扩增引物对RPA-F和RPA-R，序列如SEQ No.2和SEQ No.3所示。单链DNA探针的序列如SEQ No.6所示。

本发明的另一个目的是提供所述试剂盒进行化脓链球菌快速检测的方法，通过以下步骤实现：

具体步骤为：取1ml样品，95-98摄氏度加热5min，取1μl作为检测样品，加入14.75μl水化TwistAmp basic kit反应干燥球(TwistDx公司)，0.9μl 10mM RPA-F(序列为SEQNo.2)和RPA-R(序列为SEQ No.3)，0.375μl Ribonuclease Inhibitor(Takara公司)，3.5μlbuffer2.1(NEB公司)，1000nM向导RNA(序列为SEQ No.1)，250nM Cas12a(NEB公司)，200nM单链DNA探针(上海生工，序列为SEQ No.6)，加水补至25μl。37摄氏度反应25-45min，通过荧光显微镜下直接观察检测体系荧光变化，进行化脓链球菌检测；发黄绿色荧光说明有化脓链球菌污染，不发光说明没有化脓链球菌污染。本方法可以将化脓链球菌与其他链球菌，包括停乳链球菌、无乳链球菌区分开来。

其中：

所述单链DNA探针ssDNA序列(SEQ No.6)为：5’6-FAM-TTATT-3’BHQ1，由上海生工合成。