[发明专利]一种血红蛋白偶联物的制备方法

说明书

本发明涉及生物制药技术领域，特别涉及一种血红蛋白偶联物的制备方法。该制备方法包括如下步骤：分离红血球、溶血、分离血红蛋白与细胞膜基质、层析纯化、修饰反应、灭活病毒、超滤换液层析。该制备方法解决了急性失血及失血性休克的用药问题，缓解了血源短缺的现状；使用时无需适配血型，保存期长，由于制备过程中采用严格的病毒灭活工艺，杜绝了人畜共患病毒的污染，产品直接填补国际空白市场；实现规模化生产。

技术领域

本发明涉及生物制药技术领域，特别涉及一种血红蛋白偶联物的制备方法。

背景技术

生物制药行业，乃至兽用生物制品都是我国相对薄弱产业，发展空间极大，是国家支持重点，市场有需求；行业要创新，急需核心技术。社会变化、环境影响致使“血荒”严重，一旦进入战争、自然灾害等非常时期，更是雪上加霜，人类如此，动物也不例外，当下，动物因瘟热等引发内出血日益突出，市场根本没有具有携氧能力输血产品，因此，急需解决上述国家问题、社会紧迫问题。血液的替代品在生物制药领域只有美国进行研究生产，其主要用于战争士兵携带血浆用于急救。国内主要有北京凯正生物工程发展有限公司从事这方面的研究并成功生产了动物的血液代用品。

目前国内用聚乙二醇修饰血红蛋白偶联物来替代血液红细胞的研究中，可见用单甲氧基聚乙二醇琥珀亚胺酯为修饰剂对牛血红蛋白进行修饰的文献报道；还可见将血红蛋白用聚乙二醇-聚乳酸羟基乙酸嵌段共聚物纳米粒包裹后得到包裹血红蛋白的文献报道；以及采用双乳法制备负载型血红蛋白组合物的文献报道。聚乙二醇修饰又称分子的PEG化，是上世纪末期发展起来的蛋白质药物修饰方法，是将活化的聚乙二醇与蛋白质分子相偶联，影响蛋白质的空间结构，是最终导致蛋白质各种生物化学性质的改变：PEG修饰能增加蛋白质药物的稳定性，提高抵抗蛋白酶水解的能力，降低或去除免疫原性和毒性，延长药物在体内半衰期及降低血浆清除率。蛋白质药物的PEG化研究，是生物制药领域的热点和难点。

吉林省的牛血基本用于食材、饲料、肥料，而粗提取、添加剂和保健品等综合利用只占很少部分，由于缺少有效利用的和高附加值产品进行牛血高效转化，致使原料牛血价格低廉，加之管控不善，屠宰过程直接废弃排放，导致地下水污染，废弃牛血极易变质产生异味污染空气，滋生细菌，这些都造成极大压力。在全省年产牛血副产品多达2万吨，蕴藏血红蛋白2000吨以上，按目前血红蛋白生物转化技术水平，利用其中1％就可创造4亿产值，若1/3为转化药用生化产品，就能造就百亿产业并且动物急性失血及失血性休克用药市场至少3亿市场。

目前，单甲氧基聚乙二醇修饰的血红蛋白的制备工艺只适用于实验室小规模生产，速度慢，生产时间长；缺乏连贯性，不能连续生产；选用的实验设备价格昂贵，回收率低；人与物料接触频繁，容易污染，无法实现规模化大生产。为了解决急性失血及失血性休克的用药问题，缓解血源短缺的现状，如何采用牛血快速、大规模制备血红蛋白偶联物成为了研究热点。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种血红蛋白偶联物的制备方法。该制备方法解决了急性失血及失血性休克的用药问题，缓解了血源短缺的现状；使用时无需适配血型，保存期长，由于制备过程中采用严格的病毒灭活工艺，杜绝了人畜共患病毒的污染，产品直接填补国际空白市场；实现规模化生产。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种血红蛋白偶联物的制备方法，包括如下步骤：

分离红血球：将牛血在低温冷冻条件下进行离心，得到红血球；

溶血：在氮气保护、4～8℃条件下，往溶血罐内加入4～8倍红血球重量的、pH为7.4±0.1、渗透压130±10mOsm的低渗溶液，搅拌60～100min，得到溶血后溶液；

分离血红蛋白与细胞膜基质：将溶血后溶液进行切向流过滤，除红血球残骸；

层析纯化：超滤浓缩换阴离子层析液，当血红蛋白含量达到11～13g/dL时停止超滤，得到超滤后溶液；将超滤后溶液进行阴离子交换层析，去除磷脂、杂蛋白；