[发明专利]一种3型鸭甲肝病毒突变基因ISA-A117C-C4334A及构建方法

说明书

本发明公开了一种3型鸭甲肝病毒突变基因ISA‑A117C‑C4334A及构建方法，所述的突变基因ISA‑A117C‑C4334A以3型鸭甲肝病毒强毒株基因组5'UTR的第117位核苷酸由A突变为C；第4334位核苷酸由C突变为A，从而使病毒2C蛋白的第71位氨基酸由亲本株的亮氨酸突变为异亮氨酸。突变基因病毒株对雏鸭致病力已明显下降，突变基因病毒株能够在雏鸭体内复制但对雏鸭不致病，具有良好的安全性，这为该病毒致病机制及疫苗研制奠定了重要基础。3型鸭甲肝病毒突变基因ISA‑A117C‑C4334A病毒株是一株理想的疫苗候选株；同时，也为鸭肝炎病毒宿主嗜性和毒力变化的病毒基因及其关键位点研究提供了基础材料，应用前景广阔。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具株涉及一种3型鸭甲肝病毒突 变基因ISA-A117C-C4334A及构建方法。

背景技术

鸭病毒性肝炎(Duck viral hepatitis，DVH)是由鸭肝炎病毒(Duck hepatitisvirus，DHV)感染雏鸭引起的一种急性、高度接触性传染病。 目前世界上主要养鸭地区均有本病的存在，具有间歇爆发、地方流行 性等特点，是危害养鸭业的主要疾病之一。该病主要侵害四周龄以内 的雏鸭，具有发病急，传播迅速，病程短和死亡率高等特点；临床主 要表现为雏鸭死前发生痉挛，头向背部后仰，呈“角弓反张”，病理 变化主要为剖检可见肝脏肿大发炎和大量的出血性斑点。该病主要由 属于小RNA病毒科禽肝病毒属的鸭甲肝病毒(Duck hepatitis Avirus， DHAV)引起。DHAV具有三种血清型，即1型、2型和3型。近年来，我国流行的DHAV主要是1型鸭甲肝病毒(DHAV-1)和3型鸭甲肝病 毒(DHAV-3)。

反向遗传操作技术是开展病毒分子生物学研究的一种重要平台， 可以在体外对RNA病毒基因组进行基因敲除、定点诱变等人工操作， 在阐明病毒致病机制和疫苗研制中能够发挥重要作用并具比自然诱 变周期短的优点。传统RNA病毒感染性克隆方法的关键是获得病毒 基因组cDNA全长片段克隆，并且病毒基因组转换为cDNA后需要克 隆到合适的载体中，为了避免病毒序列在细菌中的不稳定问题，研究 者通常采取分段克隆方法，通过小片段连接成大片段，最后将大片段 通过酶切连接的方法得到全长cDNA克隆。但是该方法酶切位点选取 限制较多，体外将多个大片段进行连接效率较低，另外一些复制酶基 因cDNA克隆在细菌中具有不稳定性，因此获得病毒基因组全长cDNA 的整个过程不仅操作步骤麻烦，而且耗时较长，成功率不高，同时， 有些病毒的全长cDNA无法克隆或是虽然能克隆进载体但在宿主菌中 易发生变异而导致不能成功拯救病毒。目前，一种被称为“感染性亚 基因组复制子(Infectious Subgenomic Amplicons)”的技术已被证实 能够在哺乳动物或蚊子细胞中实现对单股正链RNA病毒的人工拯救， 并被应用于日本脑炎病毒、西尼罗病毒、寨卡病毒、黄热病病毒、登 革病毒和人科萨奇病毒等病毒的反向遗传学研究中。该技术是一种新 型的“无细菌”反向遗传学方法，不需要获得病毒全长cDNA质粒以 及在体外获得病毒RNA转录本，可以直接通过转染具有同源区域的 DNA片段拯救病毒。具体的的来说，“感染性亚基因组复制子”采用 的技术路线是：首先通过PCR方法产生包含整个病毒基因组的重叠的 非感染性亚基因组DNA片段，这些重叠的亚基因组复制子数量可以 为3至10个，相邻的复制子之间具有100bp左右的重叠区域，同时， 第一个片段的5'和最后一个片段的3'末端分别侧接巨细胞病毒早期 启动子(Cytomegalovirus immediate early promoter，pCMV)序列、 丁型肝炎病毒核酶(Hepatitis delta virus ribozyme，HDVR)序列和猴 空泡病毒早期mRNA多腺苷酸化信号(SV40early mRNA polyadenylation signal，SV40pA)序列，这些元件能够帮助亚基因组 复制子在被混合转染到易感细胞后开始转录，并利用宿主细胞的同源 重组机制自发重组，形成具有感染性的完整病毒转录本，继而导致病 毒的复制与增殖，最终获得具有感染性的拯救病毒。