[发明专利]一种3型鸭甲肝病毒突变基因ISA-T1142A及构建方法

说明书

本发明公开了一种3型鸭甲肝病毒突变基因ISA‑T1142A及构建方法，该突变基因基因组的第3403位核苷酸的G突变为T，作为感染性克隆的遗传标记，可用来区分拯救株与亲本株以及野毒株；第1142位核苷酸由T突变为A，从而使病毒VP0蛋白的第164位氨基酸的由亲本株的酪氨酸突变为天冬酰胺。突变基因病毒株与亲本株具有相同的抗原性，而在鸭胚上具有比亲本株更高的增殖效率和病毒滴度，免疫原性和遗传稳定性良好。突变基因病毒株对雏鸭致病力已明显下降，这为该病毒致病机制及疫苗研制奠定了重要基础。综上所述，3型鸭甲肝病毒突变基因ISA‑T1142A病毒株可作为一株疫苗候选或培育毒株并可用于3型鸭甲肝病毒致弱机理研究，应用前景广阔。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种3型鸭甲肝病毒突变基因ISA-T1142A及构建方法。

背景技术

鸭病毒性肝炎(Duck viral hepatitis，DVH)是由鸭肝炎病毒(Duck hepatitisvirus，DHV)感染雏鸭引起的一种急性、高度接触性传染病。目前世界上主要养鸭地区均有本病的存在，具有间歇爆发、地方流行性等特点，是危害养鸭业的主要疾病之一。该病主要侵害四周龄以内的雏鸭，具有发病急，传播迅速，病程短和死亡率高等特点；临床主要表现为雏鸭死前发生痉挛，头向背部后仰，呈“角弓反张”，病理变化主要为剖检可见肝脏肿大发炎和大量的出血性斑点。该病主要由属于小RNA病毒科禽肝病毒属的鸭甲肝病毒(Duckhepatitis A virus， DHAV)引起。DHAV具有三种血清型，即1型、2型和3型。近年来，我国流行的DHAV主要是1型鸭甲肝病毒(DHAV-1)和3型鸭甲肝病毒(DHAV-3)。

反向遗传操作技术是开展病毒分子生物学研究的一种重要平台，可以在体外对RNA病毒基因组进行基因敲除、定点诱变等人工操作，在阐明病毒致病机制和疫苗研制中能够发挥重要作用并具比自然诱变周期短的优点。传统RNA病毒感染性克隆方法的关键是获得病毒基因组cDNA全长片段克隆，并且病毒基因组转换为cDNA后需要克隆到合适的载体中，为了避免病毒序列在细菌中的不稳定问题，研究者通常采取分段克隆方法，通过小片段连接成大片段，最后将大片段通过酶切连接的方法得到全长cDNA克隆。但是该方法酶切位点选取限制较多，体外将多个大片段进行连接效率较低，另外一些复制酶基因cDNA克隆在细菌中具有不稳定性，因此获得病毒基因组全长cDNA 的整个过程不仅操作步骤麻烦，而且耗时较长，成功率不高，同时，有些病毒的全长cDNA无法克隆或是虽然能克隆进载体但在宿主菌中易发生变异而导致不能成功拯救病毒。目前，一种被称为“感染性亚基因组复制子(Infectious Subgenomic Amplicons)”的技术已被证实能够在哺乳动物或蚊子细胞中实现对单股正链RNA病毒的人工拯救，并被应用于日本脑炎病毒、西尼罗病毒、寨卡病毒、黄热病病毒、登革病毒和人科萨奇病毒等病毒的反向遗传学研究中。该技术是一种新型的“无细菌”反向遗传学方法，不需要获得病毒全长cDNA质粒以及在体外获得病毒RNA转录本，可以直接通过转染具有同源区域的 DNA片段拯救病毒。具体的的来说，“感染性亚基因组复制子”采用的技术路线是：首先通过PCR方法产生包含整个病毒基因组的重叠的非感染性亚基因组DNA片段，这些重叠的亚基因组复制子数量可以为3至10个，相邻的复制子之间具有100bp左右的重叠区域，同时，第一个片段的5'和最后一个片段的3'末端分别侧接巨细胞病毒早期启动子(Cytomegalovirus immediate early promoter，pCMV)序列、丁型肝炎病毒核酶(Hepatitis delta virus ribozyme，HDVR)序列和猴空泡病毒早期mRNA多腺苷酸化信号(SV40 early mRNA polyadenylation signal，SV40pA)序列，这些元件能够帮助亚基因组复制子在被混合转染到易感细胞后开始转录，并利用宿主细胞的同源重组机制自发重组，形成具有感染性的完整病毒转录本，继而导致病毒的复制与增殖，最终获得具有感染性的拯救病毒。