[发明专利]一种快速构建RNA 3’端基因表达文库的方法

说明书

本发明公开一种快速构建RNA 3’端基因表达文库的方法，包括：使用带有第一接头的Oligo(dT)反转录引物对mRNA样本进行反转录，得到带有第一接头的第一链cDNA；以第一链cDNA为模板合成第二链cDNA，获得带有第一接头的双链cDNA；使用带有第二接头的转座酶复合物处理双链cDNA，在片段化的同时插入第二接头，得到带有第一接头和/或第二接头的双链cDNA片段；其中，所述第一接头与第二接头的序列不完全相同。本发明提供的该方法可有效实现针对真核生物mRNA 3’端的转录组文库构建。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域。更具体地，涉及一种快速构建RNA 3’端基因表达文库的方法。

背景技术

随着后基因组时代的来临，基因表达与转录组学研究作为一种强有力的工具，在现今的生命科学研究中占有日益重要的地位。它可以帮助人们深入了解基因结构，揭示特定条件下的基因表达情况，以及生物体应对外界环境变化的调控机制。不同于DNA水平的研究，针对mRNA的表达文库构建与检测可以更加准确、直接地反映生物个体、组织乃至单细胞水平的表达差异；作为蛋白质组学的上游研究范畴，基因表达检测在现今的基础研究与精准医疗、药物研发等领域发挥着日益重要的作用。

早期的基因表达检测，其方法主要是依据在细胞或生物体中观察到的生物化学或特定表型的变化来判断特定基因是否表达；之后随着生物化学技术的不断发展，针对特定表达产物和蛋白分子的检测方法也被应用于定性或半定量地检测基因表达，如WesternBlot技术。另一方面，分子生物学的迅猛发展，为表达检测提供了强有力的工具，最具代表性和里程碑式意义的技术当首推RT-PCR与RT-qPCR技术，研究人员可以利用该技术构建表达文库，更加灵敏、准确地定量检测特定基因的表达水平。但这些技术的共同局限，是在同一时间只能获得有限的数据量，面对日益增加的高通量、大样本检测需求则力有未逮。

基因芯片(又称微阵列)技术的兴起，使得高通量表达检测成为可能。该技术通过将大量探针分子以高密度固定于特定支持物(芯片)上后与标记的样品分子进行杂交，再通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。该技术可一次性对样品大量序列进行检测和分析，满足高通量基因表达检测需求。但是，受制于在样品制备、探针合成与固定、分子标记、数据读取与分析等各环节的技术制约，该方法在当前应用中也存在诸多不足，如成本高昂、检测灵敏度较低、重复性差等等。

二代测序技术的蓬勃发展，特别是RNA测序技术的进步，迅速推进了转录组学研究的广泛应用。目前RNA测序技术已可以在定性与定量层面上对mRNA进行有效研究，帮助人们了解细胞应答机制，推进了一系列生命科学研究乃至医学、药学相关研究与分子诊断试剂开发。

由于基因表达检测往往更多关注的是特定基因的表达水平，或者说是特定mRNA分子的绝对数量与相对数量，而非其全长精确序列，因此RNA建库在基因表达检测领域的应用，可通过仅对mRNA的3’端区域进行建库，获得一定长度的、可确定其与其它分子差异的特异性信息即可实现。基于上述原理，目前已有多种成熟的技术方案，如MARS-seq等。

但这些方案的一点共性，都是通过mRNA分子的3’端poly(A)结构对其进行反转录，进而转化为双链cDNA，再进行传统的DNA文库构建。此方法需要经历末端修复与磷酸化、加A、连接接头、文库放大以及多步纯化等一系列繁琐的操作，这些操作对于较大起始量的RNA样本尚可接受，但对于以单细胞RNA建库为代表的极低模板量mRNA建库，特别是对于某些表达水平极低的mRNA来说，其分子数目很少甚至是单拷贝级别，则十分容易导致信息的丢失。