[发明专利]基于纳米孔—微透镜扫描超分辨显微成像系统

说明书

基于纳米孔—微透镜扫描超分辨显微成像系统，涉及微观粒子超分辨成像技术领域，解决现有活体细胞在单分子尺度下的成像问题。包括扫描光学系统；Z轴扫描探测系统；倒置荧光显微成像系统以及自动定焦和锁焦系统。由纳米孔—微透镜产生的超衍射极限聚焦光斑激发样品的荧光信号，根据纳米孔—微透镜Z轴扫描探测系统确定纳米孔—微透镜聚焦光斑和样品之间距离，控制三维压电陶瓷位移台实现对样品的三维方向扫描，自动定焦和锁焦系统确定显微镜和样品的焦面以及锁定该焦面，最后利用倒置荧光显微镜对样品的超分辨成像。本发明所述的基于纳米孔—微透镜扫描超分辨显微镜可以应用于活体细胞内部的单分子成像。

技术领域

本发明涉及微观粒子超分辨成像技术领域，具体涉及纳米孔—微透镜的三维扫描与荧光显微成像技术相结合实现活细胞内部的快速超分辨成像的方法。

背景技术

传统光学显微镜由于受远场衍射极限的影响，根据瑞利判据，其分辨率一般不会超过波长的一半。而波长低于400 nm的光通常会损伤活细胞，无法应用于活细胞观测。因此，传统光学显微镜横向分辨率一般仅为230nm左右。而对于生命科学追求的是在小分子尺度对单个活体细胞的动态成像，因此围绕活体细胞的超分辨成像一直是仪器开发的热点。其中扫描电子显微镜（SEM）可以达到0.1 nm的超高分辨率，但由于生物样品无法存活于高真空环境，无法应用于活细胞。原子力显微镜（AFM）分辨率可达原子尺度，但是原子力显微镜只能通过形貌图得到少数特殊结构或化学信息。此外，由于缺乏尖端样本交互力的特异性，很难区分样品中共存的不同蛋白质。

发明内容

本发明公开一种基于纳米孔—微透镜扫描超分辨成像系统，横向分辨率可以达到5~100nm，解决了活体细胞在单分子尺度下的成像问题。

基于纳米孔—微透镜扫描超分辨成像系统，包括扫描光学系统、Z轴扫描控制系统、倒置荧光显微成像系统以及自动定焦和锁焦系统，其特征是；所述纳米孔—微透镜产生的超衍射极限聚焦光斑激发样品的荧光信号，根据纳米孔—微透镜Z轴扫描控制系统确定纳米孔—微透镜聚焦光斑和样品之间距离，控制三维压电陶瓷位移台实现对样品的三维方向扫描，自动定焦和锁焦系统确定显微物镜和样品的焦面并锁定该焦面，最后采用倒置荧光显微镜对样品的超分辨成像；

所述扫描光学系统包括激光器、偏振片、第一聚焦透镜、第一光纤耦合器、扫描探针和三维压电陶瓷位移台；

所述Z轴扫描控制系统包括近红外激光器、衰减片、第二聚焦透镜、第一光纤环形器端口、第二光纤环形器端口、第三光纤环形器端口和雪崩二极管；

所述倒置荧光显微成像系统包括显微物镜、Z轴压电陶瓷、二向色镜、发射滤光片、第三聚焦透镜和传感器；

所述自动定焦和锁焦系统包括激光二极管、空间滤波器、准直器、半透半反滤光片、长波通滤光片、第四聚焦透镜和线阵CCD；

调整激光器发出可见单色激光经偏振片和第一聚焦透镜后通过第一光纤耦合器传输至扫描探针；

所述激光经过扫描探针照射样品，由样品产生的荧光通过显微物镜汇聚，然后经过二向色镜透射，发射滤光片滤光以及经第三聚焦透镜聚焦后由传感器接收；

所述三维压电陶瓷位移台对样品扫描过程中，每移动一个点发送一个数字触发信号，所述数据采集卡根据接收的触发信号向传感器发送采集数据控制信号；

所述扫描探针固定在三维压电陶瓷位移台上，显微物镜固定在Z轴压电陶瓷上；

近红外激光器出射激光经过衰减片和第二聚焦透镜进入第一光纤环形器端口，第一光纤环形器端口将激光传输至第二光纤环形器端口，第二光纤环形器端口探测样品的后向散射光，所述后向散射光经第三光纤环形器端口后由雪崩二极管探测接收；

所述雪崩二极管根据接收的光强信号转换为电信号发送至数据采集卡，根据对电信号的处理和分析控制三维压电陶瓷位移台，实现对样品的三维方向扫描，并确定纳米孔—微透镜聚焦光斑和样品之间距离；