[发明专利]一种检测尿液中氧化三甲胺的方法

权利要求书

1.一种检测尿液中TMAO的方法，其特征在于，以同位素内标为校准品，以尿液中的肌酐含量来均一化不同个体的尿液浓度的差异，结合UPLC-MS/MS技术检测尿液中TMAO的浓度，所述方法包括：

步骤1，配制样品：

1a. 配制多个标品溶液，每个所述标品溶液包含一个浓度的TMAO标品和一个浓度的肌酐标品；多个所述标品溶液包含多个浓度的TMAO标品和多个浓度的肌酐标品；

1b. 配制同位素内标溶液，所述同位素内标溶液包含TMAO的同位素内标和肌酐的同位素内标；所述TMAO的同位素内标为TMAO的氘代化合物；所述肌酐的同位素内标为肌酐的氘代化合物；所述同位素内标溶液的溶剂为甲醇水溶液或甲醇和甲酸的混合物的水溶液；

步骤2，样品预处理，得到含同位素内标溶液的标品溶液和含同位素内标溶液的尿样，其中，所述样品预处理包括对尿液进行去除蛋白的步骤和向尿液和标品溶液中加入的同位素内标溶液的步骤；所述去除蛋白的步骤包括在所述尿液中加入有机溶剂进行沉淀得到上清液，然后对所述上清液进行滤除；在进行UPLC-MS/MS检测之前，对在步骤2中得到的含同位素内标溶液的标品溶液和含同位素内标溶液的尿样进行稀释；

步骤3，构建标准曲线，其中将步骤2的含同位素内标溶液的标品溶液进行UPLC-MS/MS测定；

其中液相色谱的检测条件为：采用Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱，柱温为30℃；进样量为5μL-10μL；流动相A为含有10 mmol/L甲酸铵的水或0.2％ v/v甲酸水溶液，流动相B为乙腈；流速为0.2 mL/min至0.5 mL/min；液相色谱分离采用二元梯度洗脱，具体洗脱参数为：0 min-5 min，3%流动相B；5 min-8 min，25%流动相B；8 min-8.1 min，90%流动相B；8.1 min-13 min，3%流动相B；

其中质谱的检测条件为：采用电喷雾离子源；离子源温度为200度-600度；离子源电压为4000V-5000V；喷嘴电压为500V-1000V；氮气流速为3 L/min-5 L/min；鞘气温度为200度-300度；鞘气流速为5 L/min-15 L/min；Nebulizer压力为45psi；检测方式为正离子检测；扫描模式为多重反应监测模式；

步骤4，获得经肌酐浓度归一化的TMAO浓度，其中将步骤2的所述含同位素内标溶液的尿样进行UPLC-MS/MS分析，结合步骤3得到的标准曲线获得TMAO浓度和肌酐浓度；获得经肌酐浓度归一化的TMAO浓度；

其中所述方法用于非诊断的目的。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述尿液选自新鲜尿液、经长期低温冻存的尿液、或干尿液；所述新鲜尿液直接进行检测；经长期低温冻存的尿液在低温冻存前在尿液中加入叠氮化钠。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤2中，所述沉淀包括在尿液中加入1ml/L甲酸的乙腈溶液；或者，所述沉淀包括在-15度至-30度，沉淀20分钟至数小时。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述多个标品溶液的数目为至少3个。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述多个标品溶液的数目为4个至10个。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述多个标品溶液的数目为4个、5个或6个。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述TMAO的同位素内标为TMAO-d9；所述肌酐的同位素内标为肌酐-d3。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤2中的所述滤除包括先高速离心，再经0.22μm滤膜过滤所述上清液。

9.根据权利要求2所述的方法，其中，在尿液中加入叠氮化钠的量为尿液体积的0.05%至5%。

10.根据权利要求9所述的方法，其中，在尿液中加入叠氮化钠的量为尿液体积的0.1%至2.5%。