[发明专利]MSI微卫星不稳定检测的标准品及其制备方法和应用

说明书

本发明涉及一种MSI微卫星不稳定检测的标准品及其制备方法和应用，包括样品提取，Q‑PCR，然后毛细管电泳，分析数据等步骤。本发明的MSI微卫星不稳定检测的标准品的制备方法，兼顾多种MSI检测标准，兼顾多种重复类型，使用范围广，符合设计原则；采用ATCC的配对细胞作为标准分析样品，性能稳定，可重复再生；采用MSI‑PCR方法检测，多次重复，数据完整、准确、可靠；分发多个单位试用，兼容不同的检测方法和分析方法，完善对应标准品的性能；可以有效的评估临床检测方法学，指导病人入组和用药，具有很好的商业前景。

技术领域

本发明涉及一种MSI微卫星不稳定检测的标准品及其制备方法和应用。

背景技术

微卫星是人类基因组的一段串联重复序列，一般在1bp～6bp之间，又被称作短串连重复(Short Tandem Repeats,STRs)或简单重复序列(Simple Sequence Repeat,SSRs)。

微卫星不稳定(Microsatellite Instability，MSI)指的是微卫星重复次数减少或者增加，微卫星不稳定的内在机制是错配修复(MMR)系统失调，从而限制了纠正微卫星自发的长度改变的体细胞突变的能力，体细胞突变积累，最终形成MSI。

错配修复(MMR)系统失调主要包含两种：1)错配修复基因MLH1,MSH2,MSH6和PMS2一个或者多个发生胚系突变，导致错配修复缺陷，MSI-H现象发生在遗传性非息肉性大肠癌(Lynch syndrome)。2)MLH1启动子区域的超甲基化，MSI-H现象会散发在结直肠癌、子宫内膜癌、卵巢癌、胃癌等多种癌症中。

MSI-PCR方法是判断微卫星不稳定的金标准，一般分为高频MSI(MSI-H)、低频MSI(MSI-L)和微卫星稳定(MSS)，研究表明检测患者的MSI分型具有重要临床意义。MSI-PCR检测方法说到底也是一种PCR反应，由于PCR技术自身的缺陷，尤其是遇到重复序列扩增时，会出现假阴性、假阳性，甚至检测不到的问题，因此我们需要阳性标准品对照，对检测体系做质控，判断整个检测体系的优劣。

发明内容

本发明的一个目的在于提出一种MSI微卫星不稳定检测的标准品的制备方法。

本发明的一种MSI微卫星不稳定检测的标准品的制备方法，包括如下步骤：S101：首先选取10～20对配对细胞，其中，二分之一为肿瘤细胞，其余为正常细胞；然后检测位点BAT-25、BAT-26、NR-21、NR-24和MONO-27来评估MSI状况，同时引入Penta C、Penta D、Amel位点；S102：收集细胞；S103：采用promega的DNA提取试剂盒，按照说明书提取DNA；S104：对提取的DNA做QC检测，Qubit 3.0检测浓度，Nanodrop检测OD260/280纯度，琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性，S105：合成引物；S106：配置PCR反应体系20ul，设计PCR程序：37℃，2分钟；94℃，10分钟；94℃，30秒，60℃，1分钟，70℃，1分钟且进行35个循环；60℃，45分钟；4℃，∞；S107：PCR产物毛细管电泳，以seqstudio基因分析仪进行毛细管电泳检测，根据基因分析仪操作说明进行选择“Fragment Analysis”检测，导出数据用GeneMapper软件分析；S108：检测峰高没有出现超阈值现象，否则应稀释PCR产物进行毛细管电泳检测；S109：以正常组织峰图作对照，比较肿瘤组织6个单核苷酸标志物BAT-26、NR-21、BAT-25、MONO-27、NR-27和NR-24和3个双核苷酸重复位点D2S123、D17S250、D5S346片段大小改变情况，产物片段变化超过2.5nt即判定该基因不稳定，反之稳定；再根据同一组织肿瘤样本和对照样本不稳定单核苷酸重复位点的个数，确定该样本微卫星状态；S110：按照步骤S101-S109重复3次，判断12个位点是否数据统一和稳定，其中，数据稳定、准确的选为标准品。