[发明专利]一种重组大肠杆菌的构建及其应用

权利要求书

1.一种重组大肠杆菌，其特征在于，同时表达鲁氏酵母的酮还原酶KRD基因和枯草芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶GDH基因。

2.根据权利要求1所述重组大肠杆菌，其特征在于，所述鲁氏酵母的酮还原酶KRD基因序列如SEQ ID NO.4所示；所述枯草芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶GDH基因序列如SEQ ID NO.9所示。

3.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，鲁氏酵母的酮还原酶KRD基因和枯草芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶GDH基因同时表达于重组大肠杆菌细胞周质空间。

4.一种权利要求1-3任一项所述的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，首先将表达载体与酮还原酶KRD基因进行体外连接，验证正确后再与葡萄糖脱氢酶GDH基因连接，通过双酶切和测序验证载体连接的正确性，正确的表达载体通过化学法转化宿主菌即完成重组大肠杆菌的构建。

5.权利要求1所述重组大肠杆菌在4-氯乙酰乙酸乙酯不对称还原制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用。

6.一种生产(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法，其特征在于，在水相反应体系中，以4-氯乙酰乙酸乙酯为原料，异丙醇为氢供体，加入权利要求1所述重组大肠杆菌进行转化反应制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯。

7.根据权利要求6所述的一种生产(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法，其特征在于，所述水相反应体系为磷酸盐缓冲液提供，磷酸缓冲液浓度为50～200mM，pH为6.0～7.0；水相缓冲液和底物4-氯乙酰乙酸乙酯的投料质量体积比为3～7:1，ml/g。

8.根据权利要求6所述的一种生产(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法，其特征在于，异丙醇与4-氯乙酰乙酸乙酯的质量比为0.3～0.8:1。

9.根据权利要求6所述的一种生产(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法，其特征在于，重组大肠杆菌菌体的质量为4-氯乙酰乙酸乙酯质量的0.5～1.5％。

10.根据权利要求6所述的一种生产(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法，其特征在于，反应温度为25～35℃。