[发明专利]新大肠杆菌表达系统

说明书

本发明公开了新大肠杆菌表达系统，属于基因工程领域。本发明以大肠杆菌为载体，建立了大肠杆菌LPXA缺失突变株，并通过在缺失突变株中引入含SEQ ID NO.1所示lpxA的质粒。应用本发明的表达系统表达目的基因，无需抗生素标签。将本发明的表达系统用于L‑苏氨酸的发酵生产，能够在不影响大肠杆菌的细胞生长的同时，提高L‑苏氨酸的产量。

技术领域

本发明涉及新大肠杆菌表达系统，属于基因工程领域。

背景技术

在大肠杆菌中为了选择和维持重组质粒，常用抗生素抗性基因作为标记物。然而，抗生素耐药基因的水平转移可导致多药耐药生物的出现。因此，几种维持质粒而不添加抗生素的方法被开发出来。第一种是FabV-三氯生系统，其中三氯生用于维持质粒，但有研究表明它可能有助于细菌耐药性的增加。第二种是基于毒素/抗毒素的系统，该系统中的质粒由毒素和抗毒素之间的平衡维持，这些毒素和抗毒素分别在基因组和质粒中表达；但是，该系统在长时间细胞培养过程中无效。第三种是避免添加抗生素的方法是从染色体中去除一个必需的基因，并将其包含在质粒中。例如，大肠杆菌中的必需基因glyA已从染色体上移除并插入到表达载体中，但在含甘氨酸的培养基中生长时，表达载体可能丢失。必需基因tpiA编码磷酸三糖异构酶，对Embden-Meyerhof-Parnas途径的关键步骤进行催化。有研究将基因tpiA已从染色体上移除并插入到表达载体中，但tpiA的高表达可能影响细胞内代谢。大肠杆菌中必需基因dapD的启动子已被lac启动子取代，因此，它与含有lacO位点的质粒共同消除对lacI的抑制作用。但这种重组菌株必须在规定的培养基中生长。

必需基因lpxA，与基因lpxB、lpxD和fabZ位于同一操纵子中，编码对脂质a生物合成途径中的第一反应进行催化的udp-n-乙酰葡萄糖胺乙酰转移酶。一般来说，细胞分裂和存活需要LPXA以及lpxA的过度表达对细胞生长没有影响。本发明以大肠杆菌为载体，建立了大肠杆菌LPXA缺失突变株，并利用该系统提高大肠杆菌L-苏氨酸的产量。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种大肠杆菌表达系统，含有缺失lpxA的大肠杆菌及携带SEQ ID NO.1所示基因的质粒。

在本发明的一种实施方式中，所述大肠杆菌的出发菌株包括但不限于E.coliBL21、E.coli BL21(DE3)、E.coli JM109、E.coli DH5α、E.coli TOP10、E.coli MG1655、E.coli TWF006中的任一种。

本发明的第二个目的是提供一种表达载体，携带SEQ ID NO.1所示基因。

本发明的第三个目的是提供所述大肠杆菌表达系统在表达目的基因方面的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述应用是将目的基因与所述质粒连接，并在所述缺失lpxA的大肠杆菌中表达。

在本发明的一种实施方式中，所述表达载体为pRSFCmlpxA。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将目的基因与所述载体连接，转入至敲除了lpxA的大肠杆菌中。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将目的基因与所述载体连接，在转入宿主细胞的同时，将宿主细胞基因组上的lpxA基因敲除。

在本发明的一种实施方式中，所述目的基因是编码目的产物的基因。

在本发明的一种实施方式中，所述lpxA基因敲除是采用pCas9Cre和pTF-A-UD进行敲除。

本发明的第四个目的是提供应用上述任一所述方法构建的基因工程菌。

本发明还要求保护所述方法在发酵生产有机酸、蛋白质、氨基酸、多糖等方面的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述应用是用于构建产L-苏氨酸的大肠杆菌。