[发明专利]一种基于纤维素酶基因表征堆肥腐熟度的方法

说明书

本发明提供一种基于纤维素酶基因表征堆肥腐熟度的方法，属于环境微生物技术领域。具体步骤是：分别提取堆肥原料和堆肥产物的DNA，利用荧光定量PCR分别扩增其16 S DNA和纤维素酶基因，以16 S DNA作为内参，根据溶解曲线法计算堆肥产物中纤维素酶基因的相对含量，当纤维素酶基因的相对含量大于5时，堆肥产物基本完全腐熟。该方法操作简单、结果稳定、省时且可靠，在富含纤维素的有机废弃物的堆肥资源化方面具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明涉及环境微生物技术领域，特别涉及一种基于纤维素酶基因表征堆肥腐熟度的方法。

背景技术

堆肥化处理，是指在人工控制的条件下，依靠自然界中广泛分布的细菌、放线菌、真菌等微生物，人为地促进可生物降解的有机物向稳定的腐殖质转化的微生物学过程。畜禽粪污经过好氧堆肥处理后：1）有机质分解转化为腐殖质，更利于植物吸收利用；2）畜禽粪污中的致病菌、寄生虫等会被杀死。用畜禽粪污做原料生产有机肥具有成本小、质量稳定、市场销售空间大等优势。因此，堆肥化已成为当前畜禽粪污无害化、资源化处理最常用的方法。

腐熟度是指堆肥产品的腐熟程度。堆肥产品的腐熟度直接关系到堆肥的质量，这是因为，如果堆肥未经完全腐熟，那么：1）堆肥产品中的微生物活性相对较高，这些微生物会与农作物竞争土壤中的营养元素（如氮元素、钾元素等），影响农作物的生长；2）植物毒性物质（如有机酸、NH₃、和乙烯氧化物等）的含量相对较高，这些物质会严重抑制植物的生长；3）施入农田后易发生“二次发酵”，进而造成烧根烧苗现象。因此，对堆肥产品腐熟度评价方法的研究一直以来都是堆肥化处理的热点问题。目前已有多种堆肥产品腐熟度的评价指标，大致可将其分为三类，即物理指标（如气味、颜色、温度、颗粒度等）、化学指标（如pH、EC、C/N、NH₄⁺-N/NO₃-N等）和生物指标（如ATP含量、N硝化程度、发芽指数等）。然而，这些评价指标测定起来比较复杂，严重制约了其在企业中的推广和应用，尤其对于中、小型企业。此外，堆肥原料多种多样，其理化性质和生物指标差别较大，这就使得当前评价指标中的任意单个指标均不能有效判断堆肥产品的腐熟与否，必须两个或多个指标相结合（Bemal等，2009）。

在堆肥化过程中，微生物首先利用堆肥原料本身已经存在的水溶性有机碳，当其不足以支持微生物的生长时，纤维素、半纤维素等不溶性有机质就会被利用。随着纤维素、半纤维素的消耗，微生物开始利用难以被分解的木质纤维素等。基于此以及微生物是堆肥化处理的关键影响因素，本发明提供一种依据堆体堆肥前后纤维素酶基因相对含量的变化表征纤维素降解菌的变化，进而评价堆肥产品腐熟度的方法，在堆肥化处理领域具有潜在的应用价值，尤其适用于畜禽粪污等富含纤维素的有机废弃物的堆肥化产品腐熟度的评价。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于纤维素酶基因表征堆肥腐熟度的方法。依据堆体堆肥前后纤维素酶基因相对含量的变化表征纤维素降解菌的变化，进而评价堆肥产品腐熟度的方法，在堆肥化处理领域具有潜在的应用价值，尤其适用于畜禽粪污等富含纤维素的有机废弃物的堆肥化产品腐熟度的评价。

本发明可通过以下技术方案实现。

一种基于纤维素酶基因表征堆肥产物腐熟度的方法，包括以下步骤：

（1）分别提取堆肥原料和堆肥产物的DNA，利用分光光度仪和琼脂糖凝胶电泳检测所提取DNA的浓度和质量；

（2）利用荧光定量PCR扩增两种样品的16 S DNA和纤维素酶基因，PCR扩增时，要求两种引物扩增条件下所用DNA模板的量相同，扩增循环数一致或具有相同的PCR扩增条件；

（3）堆肥原料和堆肥产物16 S DNA的CT值分别定义为CT_1a和CT_1b，纤维素酶基因的CT值分别定义为CT_2a和CT_2b，以16 S DNA作为内参，根据溶解曲线法计算堆肥产物中纤维素酶基因的相对含量，计算公式为。