[发明专利]一种组合酶法制备3,4-二羟基肉桂酸的方法及通过该方法生产的3,4-二羟基肉桂酸

权利要求书

1.一种组合酶法制备3,4-二羟基肉桂酸的方法，其特征在于，将3-苯基-2-丙烯酸、黄素腺嘌呤二核苷酸、乙醇以质量比为1:(1~3):(1~5)的比例溶解形成溶液，将所述溶液依次通过经固定化处理的双铁羟化酶、经固定化处理的甲苯单加氧酶处理得到粗产物，所述粗产物经过纯化后得到3,4-二羟基肉桂酸；所述双铁羟化酶来源于保藏编号为CCTCC NO.M2013444的恶臭假单胞菌，所述甲苯单加氧酶来源于保藏编号为CGMCC No. 5384的洋葱伯克霍尔德菌。

2.如权利要求1中所述的组合酶法制备3,4-二羟基肉桂酸的方法，其特征在于，所述双铁羟化酶的获取方法包括以下步骤：

从所述恶臭假单胞菌中提取双铁羟化酶基因；

对所述双铁羟化酶基因进行聚合酶链式反应扩增，并连接到克隆载体；采用限制性内切酶针对酶切位点进行酶切处理，并连接到质粒载体，获得第一重组表达质粒；

将所述第一重组表达质粒导入大肠杆菌中进行培养，获得重组表达的第一工程菌，将所述第一工程菌进行破碎分离，收集所述双铁羟化酶。

3.如权利要求2所述的组合酶法制备3,4-二羟基肉桂酸的方法，其特征在于，所述双铁羟化酶的固定化方法为：将偶联剂和/或交联剂加入含有二氧化硅载体的胶体溶液中，获得改性后的二氧化硅载体；将所述改性后的二氧化硅载体和所述双铁羟化酶加入到去离子水、醋酸盐和磷酸盐的缓冲溶液中，调节溶液pH值在5~8，再经过洗涤、过滤、干燥后获得固定化的双铁羟化酶。

4.如权利要求1中所述的组合酶法制备3,4-二羟基肉桂酸的方法，其特征在于，所述甲苯单加氧酶的获取方法包括以下步骤：

从所述洋葱伯克霍尔德菌中提取甲苯单加氧酶基因；

对所述甲苯单加氧酶基因进行聚合酶链式反应扩增，并连接到克隆载体；采用限制性内切酶针对酶切位点进行酶切处理，并连接到质粒载体，获得第二重组表达质粒；

将所述第二重组表达质粒导入大肠杆菌中进行培养，获得重组表达的第二工程菌，将所述第二工程菌进行破碎分离，收集所述甲苯单加氧酶。

5.如权利要求4所述的组合酶法制备3,4-二羟基肉桂酸的方法，其特征在于，所述甲苯单加氧酶的固定化方法为：将偶联剂和/或交联剂加入含有二氧化硅载体的胶体溶液中，获得改性后的二氧化硅载体；将所述改性后的二氧化硅载体和所述甲苯单加氧酶加入到去离子水、醋酸盐和磷酸盐的缓冲溶液中，调节溶液pH值在5~8，再经过洗涤、过滤、干燥后获得固定化的甲苯单加氧酶。

6.如权利要求3或5所述的组合酶法制备3,4-二羟基肉桂酸的方法，其特征在于，所述偶联剂为溴化氰、三氯均三嗪、酰肼、硫芥子气、钛的氯化物、锡的氯化物、锌的氯化物、钒的氯化物和铁的氯化物中的一种或两种以上；所述交联剂为戊二醛、二重氮联苯胺-2,2’-二磺酸、4,4’-二氟-3,3’-二硝基二苯砜、1,5’-二氟-2,4’-二硝基苯和甲苯-2-异氰酸-异硫氰酸盐中的一种或两种以上。

7.如权利要求6所述的组合酶法制备3,4-二羟基肉桂酸的方法，其特征在于，所述偶联剂和/或所述交联剂的重量百分比小于所述双铁羟化酶或所述甲苯单加氧酶的10%。

8.如权利要求1所述的组合酶法制备3,4-二羟基肉桂酸的方法，其特征在于，将3-苯基-2-丙烯酸、黄素腺嘌呤二核苷酸、乙醇以质量比为1:2:3的比例溶解形成溶液，将所述溶液依次通过经固定化处理的双铁羟化酶、经固定化处理的甲苯单加氧酶处理得到粗产物，所述粗产物经过纯化后得到3,4-二羟基肉桂酸。

9.如权利要求8所述的组合酶法制备3,4-二羟基肉桂酸的方法，其特征在于，调节所述粗产物的pH值小于5，并经过搅拌析晶、抽滤、洗涤、干燥后获得纯化后的3,4-二羟基肉桂酸。