[发明专利]SmbHLH92基因克隆引物、表达载体、调控丹酚酸生物合成的功能及应用

说明书

本发明公开了一条调控丹酚酸合成的丹参bHLH转录因子SmbHLH92的编码基因序列；本发明所提供的SmbHLH92基因具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，所述基因编码蛋白质具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。亚细胞定位实验表明SmbHLH92定位于细胞核；本发明构建了SmbHLH92‑RNAi载体，遗传转化丹参，获得转基因毛状根，与对照株系(转化RNAi空载体获得的株系)相比，SmbHLH92‑RNAi株系中四种酚酸类成分含量显著升高。实时荧光定量PCR结果显示丹酚酸途径关键酶基因的表达量在SmbHLH92‑RNAi株系中显著升高。本发明提供的SmbHLH92具有负调控丹酚酸类化合物生物合成的功能，该类化合物在治疗心脑血管疾病方面显示出突出疗效。本发明为利用基因工程提高丹酚酸类化合物的含量提供了一个新的研究思路，同时为开展丹参优良品种选育提供靶基因。

技术领域

本发明属于植物分子生物学及基因工程领域，具体涉及一种调控丹酚酸生物合成的 SmbHLH92转录因子的基因克隆和功能研究。

背景技术

丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)是唇形科鼠尾草属的多年生直立草本植物，其根和根茎入药，《神农本草经》将其列为上品；丹参性微寒，味微苦，具有活血祛瘀、通经止痛、清心除烦、凉血消痈之功效。丹参主要活性成分包括脂溶性丹参酮类化合物和水溶性丹酚酸类化合物。丹酚酸类化合物主要包括迷迭香酸(Rosmarinic acid，RA)、丹酚酸B(Salvianolic acid B，Sal B)、丹酚酸A(Salvianolic acid A，Sal A)和紫草酸(Lithospermic acid，LA) 等，它们在抗氧化、清除自由基等方面发挥重要作用，可以有效治疗心脑血管疾病、肝纤维化以及某些癌症。目前，丹酚酸类化合物的生物合成途径解析已较为深入，但关于调控这些化合物生物合成的分子机制研究却鲜有报道。

bHLH转录因子是植物中最大的转录因子基因家族之一，其蛋白结构域能与目的基因启动子区的顺式作用元件这一特定序列进行专一性结合，从而启动基因转录。bHLH转录因子在调控植物的生长发育、次生代谢、逆境响应和信号转导等方面发挥重要作用。目前已验证到bHLH转录因子在拟南芥、烟草和红豆杉等植物中具有调控花青素、生物碱和萜类化合物生物合成的功能；而bHLH转录因子调控丹参中丹酚酸类化合物的生物合成报道较少。

发明内容

本发明的目的在于提供一种调控丹酚酸生物合成的bHLH转录因子基因及其编码的蛋白质。

本发明的另一个目的在于验证bHLH转录因子家族成员的功能。

本发明提供的SmbHLH92基因，其核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。

本发明提供的SmbHLH92基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明设计出了扩增SmbHLH92基因特异性片段的引物，其碱基序列如SEQ IDNO.3 和SEQ ID NO.4所示。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：基于丹参全基因组及不同丹参器官/组织转录组差异表达分析筛选出可能调控丹参活性成分合成的bHLH基因家族成员SmbHLH92 编码基因。

构建重组质粒pCAMBIA1302-GFP-SmbHLH92，转化根癌农杆菌GV3101，瞬时侵染烟草叶片，荧光共聚焦显微镜观察GFP荧光，发现SmbHLH92定位于细胞核中。

构建一种含有SmbHLH92基因特异性片段的正向和反向序列的植物RNAi双元表达载体。

本发明通过发根农杆菌(ACCC10060)侵染丹参叶片，获得SmbHLH92-RNAi阳性毛状根株系。

本发明采用UPLC技术检测到SmbHLH92-RNAi转基因毛状根中丹酚酸类化合物的含量显著升高。